降胆固醇亚麻籽蛋白酶解肽的分离纯化及结构鉴定

采用Protease M对亚麻籽蛋白进行酶解,制备具有降胆固醇活性的亚麻籽蛋白酶解肽,对其进行分离纯化及结构鉴定,并合成相应多肽验证其降胆固醇活性。结果表明,经Protease M对亚麻籽蛋白酶解4 h时获得的亚麻籽蛋白酶解肽胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为47.57%;继续采用超滤技术将其分离为相对分子质量小于等于3 kDa、3~5 kDa、5~10 kDa、10~30 kDa和大于30 kDa 5个组分,发现相对分子质量小于等于3 kDa的组分胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为71.0%;再经大孔树脂对该组分进行吸附后经过不同体积分数乙醇溶液洗脱,发现75%的乙醇洗脱分离得到的组分胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为79.8%;采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）对其进一步分离纯化,收集到F9组分的胆固醇胶束溶解度抑制率最高,为85.7%;最后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)从F9组分中鉴定出6种降胆固醇亚麻籽肽,氨基酸序列分别为Ile-Ile-Pro-Ala-Phe(IIPAF)、Leu-Asn-Phe-Phe(LNFF)、Leu-Leu-Gly-Thr-Leu(LLGTL)、Ile-Pro-Pro-Phe(IPPF)、Ile-Ile-Phe(IIF)和Leu-Leu-Gly-Ala(LLGA),其胆固醇胶束溶解度抑制率分别为82.8%、77.8%、88.0%、93.5%、80.3%和87.1%。     

亚麻籽降胆固醇活性肽的酶解工艺优化及分级制备

以亚麻籽分离蛋白为原料,利用酶解工艺制备降胆固醇活性肽。对蛋白酶进行了筛选,并通过单因素实验和正交实验确定最优酶解工艺,采用超滤分离技术得到具有较高降胆固醇活性的亚麻籽肽,并对超滤前后亚麻籽肽的氨基酸组成及降胆固醇活性进行了研究。结果表明:最佳酶解工艺条件为采用Protease M进行酶解、加酶量1. 5%、底物质量分数2. 0%、酶解温度50℃、酶解时间3 h,在此条件下亚麻籽肽的降胆固醇活性最强,胆固醇胶束溶解度抑制率达53. 19%;超滤后相对分子质量小于1 kDa的多肽组分降胆固醇活性最强,胆固醇胶束溶解度抑制率达72. 39%,较超滤前提高了19. 20个百分点。氨基酸分析结果表明,超滤后相对分子质量小于1 kDa的多肽组分的总疏水性氨基酸含量明显高于超滤前,提高了15. 97个百分点,而且多肽组分中赖氨酸/精氨酸的比值低于超滤前,这可能是其降胆固醇活性强于超滤前的主要原因。     

酪蛋白源降胆固醇肽的酶解制备工艺优化

以酪蛋白为原料,采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶以及胰蛋白酶对酪蛋白进行水解,确定制备降胆固醇肽的最佳蛋白酶;通过单因素实验和响应面试验,研究水解pH、水解温度、酶与底物比、底物浓度和水解时间对酪蛋白水解度和胆固醇胶束溶解度抑制率的影响,确定最佳水解条件;而后通过超滤和凝胶过滤层析确定降胆固醇肽的初步分离工艺。结果表明:制备酪蛋白源降胆固醇肽的最佳水解工具酶是中性蛋白酶,其最佳酶解条件为反应温度51.3 ℃,酶与底物浓度比6.47%,pH6.34,底物浓度5 g/100 mL,反应时间3.5 h,胆固醇抑制率为58.25%±0.59%;Sephadex G-10分离酪蛋白降胆固醇肽条件为上样浓度80 mg/mL,上样体积2.5 mL,洗脱速度3.5 mL/min;经酶解、超滤及层析后制备的酪蛋白源降胆固醇肽峰1和峰2样品在100 μg/mL的胆固醇溶解度抑制率为24.2%±0.24%和4.3%±0.16%。经酶解制备分离后,获得具有抑制降固醇胶束溶解活性的降胆固醇肽,为降胆固醇肽的开发提供理论研究基础。     

小麦麸皮中戊聚糖的纯化分级及组成分析

用乙醇逐步沉淀和离子交换柱层析方法对麸皮中制备的水溶戊聚糖(WSP)和水不溶戊聚糖 (AEP)进行分级纯化 ,并对各组分的组成进行了分析 .结果表明 ,用乙醇逐步沉淀时 ,随着乙醇体积分数的增加 ,所得分级组分具有较高的分支 ;用离子交换柱层析时 ,WSP可分级为 2个组分 ,AEP可分级为 3个组分 ,并且用NaCl较H2 O洗脱的组分具有较高的分支和较高的相对分子质量     

大豆降胆固醇活性肽的初步分离纯化

研究了大豆降胆固醇活性肽的初步分离纯化,用Alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白得到的酶水解物经过大孔吸附树脂脱盐,并用不同浓度的乙醇以疏水性大小洗脱,得出浓度为75%的乙醇洗脱物具有最高的降胆固醇活性,将此洗脱物再经过SephadexG15凝胶过滤色谱进行分子量分级,得到了部分纯化的大豆降胆固醇肽,其最高降胆固醇活性肽是分子量大多在1000以下的小肽,抑制率为81.26%。     

大孔吸附树脂对酪蛋白非磷肽的脱盐和色谱分离

利用DA201-C大孔吸附树脂对酪蛋白非磷肽脱盐并进行分离分级.结果表明,大孔吸附树脂对酪蛋白非磷肽的脱盐率在97%以上,酪蛋白非磷肽的回收率约在95%,同时用不同体积分数的乙醇对酪蛋白非磷肽进行阶段洗脱,酪蛋白非磷肽均可以分离出3个组分.     

葛花异黄酮精制及体外降脂活性研究

目的:利用HPD-100型大孔树脂优化葛花异黄酮精制工艺,并评价其体外降脂活性。方法:通过大孔树脂柱层析法优化葛花异黄酮精制工艺,通过体外胰脂肪酶活性、胆固醇酯酶活性和胆固醇胶束溶解度法评价葛花异黄酮的降脂活性。结果:花异黄酮精制工艺如下,吸附参数:葛花异黄酮质量浓度100 mg/mL,pH 6.0,上样体积20 mL,解吸参数:洗脱液为pH 5.0体积分数70%的乙醇溶液,洗脱流速2.0 mL/min,精制后葛花异黄酮纯度可达81.47%;精制葛花异黄酮对胰脂肪酶、胆固醇酯酶和胆固醇胶束溶解度的抑制率可达40.73%,52.32%,46.17%,较未精制分别提高了26.65%,47.46%,37.53%,并存在一定的剂量效应关系。结论:葛花异黄酮可通过抑制胰脂肪酶和胆固醇酯酶的活性,降低胆固醇胶束溶解度发挥降脂作用。     

水酶法水解液中大豆多肽的吸附纯化及其氨基酸组成分析

考察大孔吸附树脂对水酶法水解液中大豆多肽的吸附性能和纯化效果,通过静态吸附和解吸实验对8种树脂进行了初步筛选,并进一步研究了上样体积、上样流速、解吸剂体积分数等条件对大孔吸附树脂纯化能力的影响。结果表明：DA201-C大孔吸附树脂对水酶法大豆多肽的吸附性能优于其他7 种树脂,其最佳动态吸附工艺为：上样体积140 mL、上样流速1.5 mL/min、水洗体积350 mL,体积分数25%、50%、75%、100%乙醇溶液分级洗脱,每次80 mL,流速2 mL/min。经纯化后各大豆多肽组分纯度均在80%以上,总回收率为95.65%,树脂吸附量为13.32 mg/g,糖类及盐类杂质分别降低51%及90%以上;乙醇分级洗脱可分离4 个大豆多肽组分,其中75%体积分数组分SP-DA75氧自由基清除能力最强,肽段的抗氧化性与其疏水性氨基酸含量及酸性氨基酸含量具有一定相关性。     

酶解乳清蛋白制备降胆固醇活性肽的工艺研究

利用生物酶技术酶解乳清蛋白,制备具有降胆固醇活性的多肽,通过响应面试验、二次旋转回归设计建立回归模型,以胆固醇胶束溶解度抑制率为评价指标,对乳清蛋白的酶解条件进行了优化。结果表明,乳清蛋白的最佳酶解条件为：酶解时间8.5 h、酶解温度55 ℃、酶解pH 8.0、加酶量4.7%、乳清蛋白含量5.8%,在此条件下,酶解乳清蛋白得到的活性肽的胆固醇胶束溶解度抑制率为18.21%。     

凝胶过滤色谱纯化乳清蛋白降胆固醇肽的研究

从乳清蛋白水解物中纯化降胆固醇活性肽,乳清蛋白经胰蛋白酶水解得到的水解物经超滤粗分离,采用凝胶过滤色谱分离纯化,并对其洗脱流动相种类、pH值和洗脱液浓度进行优化筛选,采用体外检测方法筛选出最佳洗脱条件下的具有胆固醇胶束溶解度抑制活性最高的组分,并用已知分子量的标准蛋白质凝胶层析绘制校正曲线,建立分子量的对数与出峰时间的关系。结果表明,优化的最佳洗脱液为磷酸钠溶液,研究得到了凝胶过滤色谱的校正曲线,在洗脱时间为71 min时得到的组分降胆固醇活性最高,为57.48%,经计算其分子量在2 000~4 700 u范围内。     

大豆肽的大孔吸附树脂以及凝胶过滤色谱分离

采用DA201．C型大孔吸附树脂对Alcalase水解。DH14％的大豆肽进行脱盐和乙醇分布洗脱，不同浓度乙醇洗脱物的氨基酸组成分析结果表明：洗脱是按照疏水性递增的方式进行的。乙醇浓度为75％时洗脱下来的组分都具有最高的降血压活性，其ACE抑制率为56．52％。体外模拟实验测定结果表明：经过胃肠道酶的作用，大豆肽的ACE抑制活性仍达到49．52％。采用1M的醋酸作为洗脱液可以实现75％乙醇洗脱组分的Sephadex G-15有效分离，其中ACE抑制活性最强组分的抑制率为69．57％．IC50为0．144mg／mL。     

Fractionation and identification of a novel hypocholesterolemic peptide derived from soy protein Alcalase hydrolysates

A novel hypocholesterolemic peptide was fractionated by gradient ethanol elution from a macroporous adsorption resin (MAR DA201-C), and then separated on Sephadex G-15 and RP-HPLC from a soy protein hydrolysate (SAPH DH 18%). Identification of the hypocholesterolemic peptide structure was accomplished with HPLC–MS. The peptide with the highest hypocholesterolemic activity was found in 75% ethanol fraction among the four fractions from gradient ethanol elution with MAR DA201-C. The calculated average hydrophobicity by amino acid composition of each ethanol eluted fraction suggested that the peptides could be separated in terms of hydrophobicity with MAR DA201-C. Four peaks were obtained with further fractionation on Sephadex G-15, the highest cholesterol micellar solubility inhibition rate, 81.3%, was obtained in Peak 2, corresponding to the molecular weight fraction of 300–800 Da. Fifteen main peaks were obtained with RP-HPLC fractionation, the highest cholesterol micellar solubility inhibition rate (94.3%) was in Peak 7. The amino acid sequence of this peptide was identified as WGAPSL with LC–MS and amino acid composition analysis.     

大孔吸附树脂分离纯化麦胚蛋白酶解物中的抗氧化寡肽

采用DA201-C型大孔吸附树脂对麦胚蛋白酶解物(WGPHs)进行乙醇分步洗脱,不同浓度乙醇洗脱组分的疏水性氨基酸的摩尔百分比和疏水性Q值的分析结果表明:洗脱是按照疏水性递增的方式进行的,说明利用不同浓度乙醇将WGPHs按疏水性大小初步分离纯化是可行的,含疏水性氨基酸肽段的富集显著提高了WGPHs梯度洗脱组分的体外抗氧化活性。     

鱼降压肽的大孔吸附树脂分离及其活性稳定性

采用大孔吸附树脂对碱性蛋白酶水解、水解度为34.52% 的鱼降压肽进行分离。结果表明,DA201-C 型大孔吸附树脂对鱼降压肽吸附性最好,乙醇体积分数为75% 时洗脱下来的组分具有最高的ACE 抑制活性,其IC50为1.52mg/ml。鱼降压肽中灰分由分离前的9.47% 减少到分离后的2.34%,肽和蛋白质含量分别由分离前的72.81%和81.26% 增加到分离后的80.24% 和92.42%。活性稳定性分析显示,胃蛋白酶和胰酶、中性和低酸性pH 值、55℃以下温度以及1000mmol/L 以内的NaCl 浓度对鱼降压肽的ACE 抑制活性影响较小。     

大豆肽的离子交换色谱分离及其活性评价

采用Sephadex C-25阳离子交换剂对经过DA201-C型大孔吸附树脂脱盐、乙醇梯度洗脱(75%乙醇洗脱组分)的Alcalase水解大豆肽(DH14%)进行进一步的分离纯化,并对分离得到的各组分ACE抑制活性进行了评价。试管试验确定的SephadexC-25色谱分离条件为:上样量0.004g/mLIE,起始缓冲液为1M醋酸,上样吸附率为61.19%。经SP-Sephadex C-25分离得到6个组分,其中未吸附的3个组分ACE抑制活性低,但NaCl梯度洗脱的3个组分ACE活性均为60%左右,从纯化ACE抑制活性肽的角度考虑,分离效果比SephadexG-15差。     

大孔吸附树脂对草鱼蛋白水解液脱盐的作用

为了脱除草鱼蛋白水解液中的盐,本研究筛选了4 种型号大孔吸附树脂DA201-C、DA201-M、SQT-67和D002,对水解液中草鱼多肽的吸附能力进行测定,并进行静态吸附和解吸实验。结果表明：大孔吸附树脂DA201-C对草鱼多肽的吸附效果较好,其吸附量随草鱼多肽质量浓度的增加而增加;体积分数75%的乙醇对大孔吸附树脂DA201-C的洗脱效果最佳;DA201-C大孔吸附树脂对水解液脱盐的最佳条件为上样流速0.5 BV/h,上样质量浓度为30 mg/mL,水清洗速率为2 BV/h,洗脱采用体积分数75%的乙醇以2 BV/h的流速洗脱,在此条件下大孔吸附树脂DA201-C对水解液的脱盐率达97.17%。     

大孔吸附树脂对酪蛋白非磷肽吸附性的研究

从12种大孔吸附树脂中筛选出一种对酪蛋白非磷肽(NPP)吸附性能强的树脂DA201-C,利用这种树脂研究了从缓冲液中纯化酪蛋白非磷肽。研究结果表明,NPP溶液的pH、NPP溶液流过吸附柱的速度、洗脱剂乙醇的浓度等因素都对NPP的回收率有影响。采用DA201-C大孔吸附树脂纯化NPP,回收率可达95.51%。     

Separation and purification of hypocholesterolaemic peptides from whey protein and their stability under simulated gastrointestinal digestion

In this study, hypocholesterolaemic peptides were separated from whey protein trypsin hydrolysates (WPTHs) and the inhibition of cholesterol micellar solubility (ICMS) and the stability of hypocholesterolaemic peptides after exposure to simulated gastrointestinal conditions were evaluated. Whey protein trypsin hydrolysates were concentrated by ultrafiltration and then desalted through macroporous adsorption resin DA201‐C. Sephadex G‐50 gel filtration chromatography was used to separate the hypocholesterolaemic peptides from the fraction eluted with 75% ethanol. The results suggested that the fraction obtained by gel filtration with a molecular weight (MW) ranging from 1900 Da to 3100 Da exhibited the highest hypocholesterolaemic activity. This fraction was further separated by reversed‐phase high‐performance liquid chromatography into 14 fractions; the peptides with the highest activities were obtained from the fifth peak with a MW of 2454 Da and 58.77% ICMS. The hypocholesterolaemic peptides were relatively stable when exposed to simulated gastrointestinal digestion.     

利用大孔吸附树脂DA201-C Ⅱ对燕麦蛋白水解液脱盐的研究

采用大孔吸附树脂DA201-C Ⅱ对燕麦蛋白水解液进行脱盐处理是行之有效的方法。静态吸附和解吸实验表明,大孔吸附树脂DA201-C Ⅱ对燕麦肽的吸附性能优于其他七种树脂,其最佳工艺条件为：pH4.0、多肽浓度39mg/ml 的酶解液以1BV/h 的流速上样、1BV/h 的流速水洗、1.5ml/min 的75% 乙醇解吸。在此条件下,大孔吸附树脂DA201-C Ⅱ对水解液的脱盐率为93.4%,燕麦肽的回收率可达72.3%。