Rhodococcus sp.发酵条件及其胆固醇酯酶的部分性质

Rhodococcussp.经发酵培养可合成分泌胆固醇酯酶。对该菌种进行诱导及发酵条件的优化,确定其培养基为(%):蛋白胨1.3,KCl 0.5,牛肉膏0.1,Na2HPO40.632,MgSO40.06,油酸0.4,卵磷脂0.25,Triton X-100 0.16;最适培养条件为:pH7.4,250 mL三角瓶中装量40 mL,接种量6.0%,摇床转速180r/min,30℃培养24h。在最适培养基及最适培养条件下,胆固醇酯酶比活力可达到5.47 U/mg。酶学性质研究结果表明,该酶的最适温度为40℃,最适pH为7.0。     

微生物腈水合酶的研究现状

本文对微生物腈水合酶的结构、催化机理、产生菌的选育、酶的形成条件、分子生物学、酶学特性进行了阐述。     

基于底物通道工程提升嗜热腈水合酶对烟腈的催化性能

腈水合酶(nitrile hydratase, NHase, EC 4.2.1.84)是一类将腈类化合物经水合反应生产酰胺类化合物的金属酶,工业上用该酶进行生物法生产烟酰胺。由于水合过程放热,工业用酶对其稳定性提出了更高的要求。实验室前期通过基因挖掘获得了一种来源于嗜热菌温泉热碱芽胞杆菌(Caldalkalibacillus thermarum) TA2.A1的腈水合酶基因,但其催化活性不足,难以满足应用需求。该研究基于底物通道工程,将该酶β亚基的第42位甘氨酸突变为赖氨酸后,其催化3-氰基吡啶的比酶活力提高为野生酶的2.5倍,且仍保留较好的稳定性,经5 L发酵罐培养,细胞酶活力达到5 539.0 U/mL,具有巨大的应用潜力。     

腈水合酶催化反应条件的研究

以自由细胞的酶作为催化剂,研究了菌体稀释倍数、丙烯腈浓度、温度、pH值、菌悬液用量和丙烯酰胺浓度对腈水合酶活性的影响．结果表明,温度、丙烯腈浓度和丙烯酰胺浓度是影响酶活性的主要因素．反应温度在28℃时酶活性达到最大为4091U／mL茵液,丙烯腈浓度采用40g／L．当反应体系中丙烯酰胺浓度为40％时,其酶活只有丙烯酰胺浓度为5％时酶活的39．2％．对不同反应温度下酶活的研究,得出腈水合酶催化反应的活化能为40．291kJ·mol^-1．     

高分子量腈水合酶工程菌生产烟酰胺的工艺建立

为提高表达玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous J1)来源的高分子量腈水合酶大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-nhh Brbs Arbs G(BAG)的菌体酶活,建立了合适的烟腈全细胞催化工艺以及重组工程菌的高密度发酵工艺。采用正交试验L_9(3~4)对摇瓶培养基中各组分进行优化,比较烟腈底物流加和底物分批补料工艺,对重组菌进行分批补料高密度发酵培养。培养基优化后其菌体生物量提高到4.42 gDCW/L,细胞比酶活提高到30.91 U/mgDCW;与烟腈底物流加相比,烟腈分批补料工艺更适合烟酰胺的生产,通过此工艺的反应,摇瓶发酵后的BAG能够生产390 g/L烟酰胺;对BAG进行5 L发酵罐分批补料扩大培养,菌体生物量最高达到73.97 gDCW/L(OD600=200),细胞比酶活最高为42.70 U/mgDCW,单位发酵液酶活最高为2 813 U/mL,用较高密度的发酵罐培养后重组菌进行烟腈催化反应,产物质量浓度能达到537 g/L,是已报道的大肠杆菌重组表达腈水合酶产烟酰胺所得终质量浓度的最高水平。     

新型耐热腈水合酶的异源表达及其催化工艺研究

腈水合酶(nitrile hydratase,NHase,EC 4. 2. 1. 84)是一种金属酶,能将腈类物质催化水合生成酰胺类物质,在工业上主要应用于烟酰胺和丙烯酰胺的生产。腈水合酶在应用过程中,普遍存在热稳定性较差的缺陷,而腈类的水合催化属于放热反应,在工业催化过程中,过高的反应温度使得腈水合酶的催化效率、重复利用率均较低,故寻找一种耐热型腈水合酶对工业应用以及理论研究具有重要意义。该研究以提高腈水合酶热稳定性为出发点,从美国国立生物技术信息中心通过BLAST筛选到一种新型耐热腈水合酶,该腈水合酶来源为温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillus thermarum TA2. A1),该菌株最适生长温度为65～70℃。将来源于Cal. thermarum TA2. A1的腈水合酶基因序列进行密码子优化,基因合成后在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中异源表达,通过在该腈水合酶β亚基的C端添加strep标签成功纯化该酶,测定其在65℃的半衰期为3 h,在30℃下催化烟腈的比酶活为395 U/mg,其全细胞催化反应速率比已报道数据将近快1倍,烟酰胺的最终产量提高了25%,更有...     

Pycnoporus sp. SYBC-L1 18S rDNA序列分析及其固态发酵水葫芦产漆酶的研究

从朽木上筛选到一株产漆酶的白腐真菌SYBC-L1,该菌株在PDA-Guaiacol培养基上显红色,通过18S rDNA序列测定和进化树聚类分析,表明其属于密孔菌属,命名为Pycnoporus sp. SYBC-L1。以水葫芦为基本培养基质,以漆酶活力为指标,对其产酶培养基进行了初步优化,得其适宜的培养基为:水葫芦12.5%,可溶性淀粉与豆粕质量比1∶1,起始含水量65%,Cu2+浓度1.5mmol/L,没食子酸20μmol/L,30℃,培养9d,漆酶活力可达19.17U/g,为优化前的8.75倍。Pycnoporus sp. SYBC-L1漆酶提取的适宜条件为:20mmol/L,pH6.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液,浸提3h。     

产褐藻胶裂解酶菌株Cobetia sp. WG-007的筛选及发酵优化

以褐藻酸钠为唯一碳源,从腐烂的海带中筛选出一株高效降解褐藻胶的菌株,经形态、生理生化和16S rDNA测序鉴定,将其命名为Cobetia sp.WG-007。采用单因素和正交试验优化,确定该菌株摇瓶发酵最适产酶条件为褐藻酸钠6.0 g/L,蛋白胨5.0 g/L,NaCl 20 g/L、K2HPO40.25 g/L,菌株在25℃条件下发酵培养30 h达到最高酶活,为160.7 U/mL,相比优化前酶活力提高了3.52倍。     

基于氨基酸热点突变对腈水合酶底物亲和力的改造

目的:以Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的腈水合酶为研究对象,利用半理性设计以及定点突变以获取其对烟腈底物亲和力更高的突变体.方法:通过序列比对找到同源性很高的1AHJ蛋白并采用Swiss-Model和iTASSER等软件进行评估.利用Discovery Studio 2016(DS...     

产腈水合酶菌株的驯化选育及其产酶条件的优化

以Rhodococcussp YL 1为出发菌株 ,通过逐渐增加培养基中丙烯腈的浓度重复继代培养 ,得到 1株酶活为 79 8U/mg的腈水合酶高活力菌株YL 2 ,酶活比出发菌株YL 1提高了 87%。对菌株YL 2的产酶条件进行了优化。结果表明 ,葡萄糖、诱导剂脲、Co2 + 及pH是影响腈水合酶高效表达的主要因素。在葡萄糖浓度为 2 0g/L ,诱导剂脲的添加量为 0 0 6g/L ,钴离子加入量为 0 3g/L ;培养温度为 30℃ ,培养基初始 pH为 7 0的条件下培养 4 0h后 ,酶活可达 134 5U/mg ,比优化前提高了 6 9%。     

培养基及培养条件对Pycnoporus sp. SYBC-L1分泌漆酶的影响

从作者所在实验室保存的3株白腐真菌中筛选到一株液态发酵产漆酶的密孔菌Pycnop-orus sp.SYBC-L1,以漆酶活力为指标,采用正交试验法,优化了Pycnoporus sp.SYBC-L1分泌漆酶的培养基:麸皮水煮液60 g/L,葡萄糖60 g/L,豆粕粉15 g/L,CuSO_4·5H_2O 1.0 mmol/L;培养条件:初始pH 3.0,装液量50 mL/250 mL,30℃、200 r/min培养13 d,漆酶活力达24.95 U/mL,为优化前的36.16倍.     

北极海洋红球菌B7740（Rhodococcus sp.）产类胡萝卜素和类异戊二烯醌的抗氧化、抗增殖活性

本实验旨在研究来自北极海洋红球菌B7740类胡萝卜素和类异戊二烯醌提取物（B7CIQE）的体外抗氧 化活性（通过β-胡萝卜素漂白测定、脂质和蛋白质氧化抑制实验、DNA氧化断裂抑制实验）、抗增殖活性（通过 抗人肝癌细胞HepG2和人口腔癌细胞KB增殖实验）和细胞内抗氧化效果。实验中使用日常饮食常见高等植物来 源类胡萝卜素（β-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素）作为对照组,评价B7CIQE的生物活性：β-胡萝卜素氧化抑制 率为B7CIQE（70.20%）＞2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（66.70%）＞表没食子儿茶素没食子酸酯（17.80%）＞番茄 红素（1.90%）;油脂开始氧化的温度顺序为B7CIQE（175 ℃）＞β-胡萝卜素（165 ℃）＞叶黄素（162 ℃）＞ 番茄红素（160 ℃）;蛋白质氧化抑制率为B7CIQE（25.75%）＞β-胡萝卜素（24.97%）＞叶黄素（17.94%）＞ 番茄红素（10.40%）;HepG2细胞抗增殖实验半最大效应浓度为叶黄素（20.86 μg/mL）＜β-胡萝卜素 （124.88 μg/mL）＜B7CIQE（126.34 μg/mL）＜番茄红素（139.24 μg/mL）;KB细胞抗增殖实验半最大效应浓度为 B7CIQE（25.14 μg/mL）＜叶黄素（64.29 μg/mL）＜番茄红素（69.87 μg/mL）＜β-胡萝卜素（149.16 μg/mL）。结 果表明,与植物源类胡萝卜素相比,B7CIQE具有相对更优异的抗氧化和抗增殖活性。     

足球菌ISK—1的发酵产物足球菌素ISK—1的生产最适化

研究了足球菌ＩＳＫ－１发酵中温度，ｐＨ值以及无机阳离子对足球菌素ＩＳＫ－１活性的影响，３７℃，ｐＨ值为５．５～６．０是产生足球菌素ＩＳＫ－１的较适宜条件，Ｍｎ＾２＋和Ｍｇ＾２＋对足球菌素ＩＳＫ－１的产生是必需要，而Ｎａ＾＋，Ｃａ＾２＋，ＮＨ４等阳离子均能提高足球菌素ＩＳＫ－１的活性，其中以Ｎａ＾＋的效果最显著。     

Alcaligenes sp.NX-3产威兰胶的补料分批发酵工艺研究

在7.5L发酵罐上考察了Alcaligenes sp.NX-3产威兰胶的发酵工艺。选用葡萄糖为碳源,通过分析比较不同初糖浓度下的细胞比生长速率和产物比合成速率,进一步研究了不同补料方式对产胶的影响。结果表明,采用分批补糖发酵工艺,威兰胶产量较分批发酵提高了13.6%,而且有效地缩短了发酵周期。在50L发酵罐上进行补料分批发酵放大实验,威兰胶产量高达27.0g/L,葡萄糖转化率由初始的44%提高到54%。     

NaCl对足球菌ISK—1的发酵产物足球菌素ISK—1活性的影响

研究了足球菌ＩＳＫ－１发酵中ＮａＣｌ对足球菌素ＩＳＫ－１活性的影响。在ＭＲＳ培养基中添加８％的ＮａＣｌ，发酵２１￣２４ｈ，足球菌素ＩＳＫ－１活性达到最高，比无ＮａＣｌ时提高２５％。表明ＮａＣｌ具有提高足球菌素ＩＳＫ－１活性的作用。     

青霉菌P1木聚糖酶固态发酵研究

研究了青霉菌P1菌株产木聚糖酶的时间曲线，氮源组成，添加物，发酵起始pH值，接种量及发酵温度对产酶的影响。该菌经28℃培养4天，酶活力可达1353．5Iu／g干培养基。酶的最适反应温度为50℃，最适PH为4．6。该酶在50℃以下时热稳定性较高。     

产胞外多糖芽胞杆菌的发酵动力学研究

对芽胞杆菌胞外多糖发酵动力学进行了研究.基于Logistic和Luedeking-Piret方程,得到了描述芽胞杆菌发酵过程菌体生长、多糖形成、底物消耗的动力学数学模型和模型参数.模型反映了该菌株发酵过程的动力学特征,模型值与实验数据拟合良好,平均误差小于10%.     

Serratia sp. SYBC H发酵浮萍生产蛋白酶的研究

以富含蛋白质的浮萍作为有机氮源,接种一株通过自然筛选而得的新颖菌株Serratia sp.SYBC H,进行微生物发酵生产稀有的蛋白酶,为浮萍的高值化利用开创一条新途径。先采用单因素实验,研究影响Serratia sp.SYBC H发酵浮萍生产蛋白酶的发酵时间,碳源,C/N比,无机盐,产酶添加剂,结果发现:以小麦粉为碳源,小麦粉与浮萍比例为1:2,Na Cl,表面活性剂吐温80,显著促进Serratia sp.SYBC H生产蛋白酶。接着采用正交试验,研究影响Serratia sp.SYBC H生产蛋白酶的发酵培养基的主要组成及其使用量。结果显示,在实验范围内,影响Serratia sp.SYBC H生产蛋白酶的发酵培养基组成及其最佳使用量为小麦粉15 g/L,浮萍30 g/L,吐温80,0.8%(V/V),Na Cl 0.05 mol/L。接种发酵18 h后,蛋白酶的生产值达到最大值,发酵液中最高蛋白酶活达到1459.94U/mL。