克雷伯杆菌利用生物柴油副产物甘油生产氢气和1,3-丙二醇的研究

以Klebsiella pneumoniaeDSM2026为出发菌株,通过紫外线诱变,选育得到能耐较高浓度生物柴油副产物甘油生产H2和1,3-丙二醇(1,3-PD)的菌株21株,命名为Kp1~Kp21。通过比较,Kp8菌株产量最高,1,3-PD和H2产量分别达到0.36 g/50 mL和0.99 mmol/50 mL,比出发菌株分别提高了3.5倍和4.2倍。对Kp8菌株发酵条件进行优化,得到最佳培养条件为pH 7.0,培养温度37℃,接种量10%(v/v),废甘油浓度为30 g/L。在该条件下H2产量为1.0 mmoL/50 mL,1,3-PD产量为7.5 g/L,甘油转化率为83.3%。     

克雷伯氏菌发酵条件的响应面设计

以中心组合设计为基础利用响应面法,对克雷伯氏菌利用甘油生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的培养条件进行优化,建立了以甘油、硫酸铵、pH值、发酵时间、和发酵温度对1,3-PD发酵生产的单个因素和交互影响的数学模型,得到发酵生产1,3-PD的最佳条件为:甘油49.9g/L;硫酸铵5.28g/L;pH值为7.19;培养时间84h;温度36.1℃。在此条件下,模型预测1,3-PD最大产量为19.03g/L。并在此条件下进行实际实验,1,3-PD的产量为18.33g/L,与模型预测接近。     

强化乙醛酸和TCA循环对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)代谢甘油合成1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PDO)的过程中,存在乙酸溢流、TCA循环活性低的问题,影响1,3-PDO合成。该研究对K.pneumoniae中乙醛酸循环抑制因子iclR进行敲除,并过表达TCA循环中琥珀酸脱氢酶基因sdhC和苹果酸脱氢酶基因mdh,缓解乙酰辅酶A节点的碳流溢出。结果表明,敲除iclR后乙酸积累量降低了41%,1,3-PDO产量提高了8%。在K.pLric中单独过表达sdh C或mdh基因,2,3-丁二醇产量分别降低了47%和52%,1,3-PDO产量分别提高了7%和8%。共表达sdh C和mdh基因后,菌株的甘油利用能力增强,1,3-PDO产量比K.pLric提高了11%。5 L发酵罐分批补料发酵结果表明,K.pLric-sdh C-mdh的生物量明显提高,1,3-PDO产量达77.2 g/L,摩尔转化率为0.69 mol/mol。以上结果表明,敲除iclR激活乙醛酸循环、过表达sdh C和mdh强化TCA循环可以弱化乙酸溢流,增强菌株的甘油利用能力,促进合成1,3-PDO。     

灵芝菌体液态深层发酵条件的优化

研究摇瓶灵芝菌体液态深层发酵温度和初始pH 值,在此基础上进行5L 发酵罐批次培养,研究发酵过程pH 值控制、溶氧控制对灵芝菌体生长和灵芝胞外多糖的影响。结果表明：发酵温度30℃,初始pH 值为6.0;过程pH 值控制策略：菌体生长前期(0～40h)控制pH 值为5.5,40～48h 控制pH 5.0,48h 后至发酵结束控制pH4.5;溶氧控制策略为：搅拌转速160r/min,通风量0.75vvm。优化后的验证实验结果：灵芝菌体生物量最高达到19.7g/L,胞外多糖最高达到3.23g/L,较优化前灵芝菌体生物量12.8g/L 和灵芝胞外多糖2.39g/L 分别提高了53.9% 和35.1%。     

不同补料方式对酿酒酵母高密度发酵的影响

以酿酒酵母为发酵菌种,使用自主优化筛选配制的糖蜜培养基,分别采用残糖反馈分批补料和连续流加补料方式,优化发酵工艺条件以提高发酵液中菌体密度。残糖反馈分批补料,拟设定3个梯度,分别控制对数期发酵液中残糖含量在0.5%～1.5%,1.0%～2.0%,1.5%～2.5%。三次试验结果分别为,试验1菌体培养32 h时达到最大生物量,为28.88 g/L;试验2菌体培养52 h时达到最大生物量,为27.43 g/L;试验3菌体培养24 h时达到最大生物量,为22.06 g/L。通过连续流加补料培养菌体,结果培养30 h时达到最大生物量,为29.29 g/L。     

发酵后期补加2种氮源对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

为探寻解决重要平台化合物1,3-丙二醇发酵后期菌体生长和1,3-丙二醇合成受限的方法,通过从菌体量、产物和关键酶活性及基因转录水平等方面,较全面地考察了发酵后期补加酵母膏和硫酸铵对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)合成1,3-丙二醇的影响,结果为:添加两种氮源均有利于菌体生长;补加10 g/L酵母膏和硫酸铵,1,3-丙二醇产量由58.6 g/L分别提高到70.6 g/L和77.2 g/L;相对于酵母膏,硫酸铵对关键酶活性的增强更为明显,并使甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase,Dha D)在发酵后期始终维持较高水平,促进细胞生长和产物合成。此外,与补加酵母膏相比,补加硫酸铵后关键酶基因转录水平上调并不显著。表明硫酸铵主要通过直接激活关键酶活性促进细胞生长和产物合成。综上所述,发酵后期补加硫酸铵更利于1,3-丙二醇的生物合成,是提高发酵合成1,3-丙二醇水平的有效方式之一。     

指数补料发酵提高鲁氏酵母β-1,3-葡聚糖酶产量

高耐盐鲁氏酵母A菌株(耐24%盐)10 L发酵罐产β-1,3-葡聚糖酶的过程中,葡萄糖(YEPD)是鲁氏酵母A生长和产酶的最适碳源,其发酵效率显著高于甘油(YEPG)和乙醇(YEPE),而乙酸钠的可利用性较差。YEPD批培养生长效率(生物量)、最大酶活力以及酶产率分别比YEPG和YEPE批培养提高了1.89%和29.88%、114%和19.65%以及188%和33%。与YEPD批培养相比,15~23 h开始指数流加YEPF培养基,达到最大生物量的周期缩短12 h,最大生物量提高19.29%,而且β-1,3葡聚糖酶几乎以对数增长的方式提前6 h合成到最大酶活力(44.99 U/m L),酶产率提高了76.86%,达到2.14 U/(m L·h),实现了指数补料发酵的目的。研究结果确定了有效提高鲁氏酵母A生物量和β-1,3-葡聚糖酶产量的指数补料模型,为高耐盐鲁氏酵母菌剂和β-1,3-葡聚糖酶产品有效生产以及其在高活性酿造功能食品行业的应用打下了基础。     

产β-葡聚糖酶耐盐鲁氏酵母的筛选及鉴定

从农家自制辣椒酱中分离纯化了一株耐盐酵母,通过β-1,3葡聚糖酶鉴定(刚果红染色法)确定其具有合成、分泌胞外β-1,3葡聚糖酶特性。Na Cl耐受性研究确定其具有高耐盐性,能经144 h的适应期后在24%Na Cl的培养基B中稳定生长120 h。经26s r RNA基因序列分析鉴定为鲁氏酵母A(Z.Rouxii A)。Z.Rouxii A发酵培养中存在二次生长现象,其生物量在24 h和48 h达到峰值,分别比18 h的6.38 g/L提高了46.55%和87.15%,而21 h后葡萄糖浓度仅维持在1.57 g/L左右,说明:Z.Rouxii A生长过程中合成、分泌的β-葡聚糖酶持续降解发酵培养基中添加的β-1,3-1,6-葡聚糖,为其二次生长提供了碳源和能源。Z.Rouxii A的β-1,3-葡聚糖酶活性曲线与生长曲线基本趋势一致,最大酶活性随着菌体自溶(12 h、24 h和48 h)而迅速降低,48 h达到酶活峰值15.23 U/m L,说明:Z.Rouxii A的β-1,3-葡聚糖酶合成与细胞生长偶联。以上数据确认该菌为产β-葡聚糖酶高耐盐鲁氏酵母。     

利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸

本文探究以甘油为唯一碳源发酵合成L-丙氨酸的可行性。以删除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径的Escherichia coli B0016-050为出发菌株,用λpL启动子及其调控下的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的丙氨酸脱氢酶基因(ala D)替换B0016-050菌株染色体上丙氨酸消旋酶基因(dad X),获得温度控制型L-丙氨酸合成菌株B0016-060BC。菌株B0016-060BC以甘油为唯一碳源进行两阶段发酵(包括菌体生长阶段和L-丙氨酸合成阶段),表明在菌体生长至对数后期起始L-丙氨酸合成或者提高L-丙氨酸发酵阶段的通气量可提高L-丙氨酸合成水平。进一步经5 L发酵罐发酵,可合成63.64 g/L L-丙氨酸,整个发酵阶段体积生产强度达到1.91 g/L h、转化率达到62.89 g/100 g甘油,仅合成少量的乙酸(1.73 g/L)等副产物。实现了以甘油为唯一碳源高效合成L-丙氨酸,为工业应用提供了重要参考。     

磷酸转移酶系统关键基因敲除对Klebsiella pneumoniae产1,3-丙二醇的影响

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)在以葡萄糖作辅底物发酵甘油生产1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PDO)过程中,由于细胞存在碳分解代谢抑制现象,葡萄糖优先于甘油被菌体吸收代谢用于细胞生长及副产物的累积,影响1,3-PDO的合成。基于K.pneumoniae葡萄糖转运及碳代谢调控相关的磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS),利用Red重组技术对PTS系统中与葡萄糖特异性转运相关的基因ptsG(编码葡萄糖特异性转运膜透性酶EⅡBC~(Glc))、crr(编码胞浆可溶性葡萄糖特异性转运酶EⅡAGlc)分别进行敲除,并考察上述基因缺失对细胞生长、1,3-PDO合成和副产物代谢的影响。结果显示,敲除ptsG、crr基因后,甘油转化率较野生菌分别提高26.2%和42.7%,其中突变株K.pneumoniaeΔcrr的1,3-PDO的产量达到23.1 g/L,提高35.8%。上述结果表明,敲除ptsG、crr基因改造PTS系统能够有效提高底物甘油利用率,强化1,3-PDO合成。     

两步发酵法生产1，3-丙二醇的研究

通过几种不同原料制备的甘油对克雷伯杆菌厌氧发酵生产1,3-丙二醇的影响的比较实验,验证了两步发酵法生产1,3-丙二醇工艺路线的可行性。在甘油初始浓度相同(70g/L)的条件下,以葡萄糖为原料进行发酵得到的甘油转化为1,3-丙二醇的效果较好,发酵15 h,甘油转化为1,3-丙二醇的摩尔转化率为45．1%；皂化甘油生产1,3-丙二醇的发酵时间为18h,摩尔转化率为44．2%；而以玉米淀粉水解液发酵的甘油转化为1,3-丙二醇需要31 h,摩尔转化率仅为26．5%。     

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇aldH基因缺失菌株的构建

该研究利用λRed重组技术对克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）中的乙醛脱氢酶（aldH）基因进行敲除,成功构建缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH,与原始菌株相比,缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH发酵液中乙醇产量由原来的7.24 g/L降为0.47 g/L,降低了93.51%;1,3-丙二醇产量由原来的78.83 g/L增长至82.55 g/L,提高了4.72.%;甘油转化率由60.64%增长至63.50%,提高了2.86%。缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH 50 L发酵罐小试试验中,1,3-丙二醇的产量为78.13 g/L,乙醇产量为0.50 g/L。     

Klebsiella pneumoniae连续发酵生产1,3-丙二醇的工艺优化

微生物发酵法生产1,3-丙二醇的常用方式是批式流加发酵,但是发酵时间较长,产物的生产强度较低,而连续发酵生产1,3-丙二醇,通过物料不断流动使发酵达到动态平衡,可有效提高生产强度。该文以已建立的批式发酵动力学模型为基础,对克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae HR526)连续发酵生产1,3-丙二醇的工艺进行了研究,优化得到了使得产物浓度最大的稀释率参数,并分析比较了不同稀释率条件下的单级和多级连续发酵的实验结果。结果表明,最佳的连续发酵方式是二级连续发酵,总稀释率为0.028 h-1时产物浓度达到68.11 g/L,生产强度达到1.89 g/(L·h),与48 h的批式流加发酵相比,生产强度提高了27.7%。     

1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD在肺炎克雷伯氏菌中的表达研究

以大肠杆菌(Escherichia coli)基因组为模板,PCR扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD,经测序确认,将yqhD基因与四环素抗性基因TetR同时插入表达载体pUC18构建重组质粒pUC18-yqhD-TetR,重组质粒转化Klebsiella pneumoniae ME308;37℃,经1.0mmol/LIPTG诱导8h,重组肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶的酶活力达到4.16U/mg,而对照菌株的酶活仅为0.62U/mg;将重组菌在摇瓶中进行微氧发酵培养,经IPTG诱导,可将60g/L甘油转化为33.8g/L1,3-丙二醇。     

Klebsiella pneumoniae在不同发酵罐中发酵甘油制1,3-丙二醇的控制条件研究

对克雷伯氏肺炎杆菌间歇发酵甘油产生1,3-丙二醇的发酵条件进行了优化,确定了50L搅拌式发酵罐和15L气升式发酵罐发酵的最佳发酵条件,得到的1,3-丙二醇的浓度、生产率和甘油摩尔转化率分别是80.97g/L、1.69 g/(h·L)、0.57 mol/mol和74.81 g/L、1.56 g/(h·L)、0.50 mol/mol;对比了不同类型发酵罐的发酵结果,表明50 L搅拌式发酵罐发酵结果优于15L气升式发酵罐,前者相对于后者来说,1,3-丙二醇的浓度和甘油摩尔转化率分别提高了8.23%和14.91%;确定了最适底物浓度(以初始甘油浓度计)在25 g/L左右。     

克雷伯氏菌固定化技术发酵生产1,3-丙二醇

通过对4种常见的包埋材料固定化克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇的研究发现,海藻酸钙固定化无论在制备难易还是在发酵强度上都有很大优势,并进一步确定了海藻酸钙固定化的最优条件:海藻酸钠质量浓度6%,CaCl2质量浓度4%,交联时间4 h。相对于游离发酵,固定化发酵1,3-丙二醇终浓度提高了7.4%,发酵强度达到了1.04 g/(L.h)。此外,固定化克雷伯氏菌还能用于1,3-丙二醇半连续发酵。     

利用甲醇厂CO_2尾气培养小球藻

利用甲醇厂所排放的高浓度CO2尾气培养小球藻,研究不同的通气方式、培养方式对小球藻生长的影响。实验结果表明,当通气速率为300 mL/min、CO2浓度为10%并以10 min/h的间歇通气方式培养时能够提高小球藻的生物量,生物量和产率分别为0.681 g/L和0.082 g/(L.d)。对氮源和磷源采用补料的方式进行培养时对小球藻生长具有促进作用,最高生物量和产率分别达到0.789 g/L和0.088 g/(L.d)。当培养基的更新率为20%时能够获得较高的生物量。利用醋酸进行兼性培养时,一次性添加50～125μL/L醋酸都可促进小球藻生长,每日添加10～25μL/L的醋酸时,可明显促进小球藻生长,最高生物量和产率分别为0.933 g/L和0.111 g/(L.d),分别是空气对照的1.3倍和1.4倍。说明利用甲醇厂高浓度CO2尾气培养小球藻提高生物量是可行的。     

UV、LiCl复合诱变深黄被孢霉选育γ-亚麻酸突变株

以深黄被孢霉（Mortierella isabellina）AS3．3410为出发菌株，经UV、LiCl复合诱变处理，随机筛选后复筛，最终获得一株突变株SHFU-13。其种子发酵2d，摇瓶发酵8d时，生物量和总脂量分别达21．66、12．65g/L，在同等条件下比出发菌株分别提高了8．84％和36．61％。气相色谱分析其油脂组成，γ-亚麻酸含量为6．39％，产量为0．81g／L，产量较对照样提高44．64％。连续传代多次，其产量性状无显著变化。     

Lactobacillus brevis W5-17产生1,3-丙二醇的条件研究

从酸败果酒中分离到1株可同时利用葡萄糖和甘油产生1,3-丙二醇的乳杆菌,经鉴定为Lactobacillus brevis。当葡萄糖∶甘油为0.05mol/L∶0.1mol/L时,厌氧发酵70h,1,3-丙二醇产量为11.2mmol/L,生成速率为0.16mmol/(L.h),甘油的转化率为0.30mol/mol,甘油脱水酶活性为0.84U/mL,1,3-丙二醇氧化还原酶活性为3.80U/mL,该研究为过量生产1,3-丙二醇的乳酸菌工程菌株改造奠定了基础。