生物合成γ-氨基丁酸酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

为了提高酵母菌的γ-氨基丁酸产量,本研究以十六烷基三甲基溴化铵法(hexadecyl trimethy ammonium bromide,CTAB)提取的酿酒酵母28基因组DNA为模板,扩增得到序列长度为1 758 bp的GAD1基因,经比对与S.cerevisiae S288c的一致性达到98.58%,并设计引物扩增包括GAD1基因上游启动子及调控序列,下游终止子在内的全长基因序列,长度为3 490 bp。将全长基因序列克隆至高拷贝质粒p UG6,构建重组质粒p28。以菌株28作为出发菌株进行转化,经G418抗性筛选得到转化子,进一步经过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)实验验证,质粒提取及酶切验证,确证得到重组子DL28。经重组质粒p28的特性研究得知,重组质粒p28具有良好的遗传稳定性,无抗性传代培养10次重组质粒不丢失。转化后进行酶活力测定,重组子DL28的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)酶活力比菌株28提高73.8%。通过以上实验结果得出结论,GAD基因高表达菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性。     

利用米糠谷氨酸脱羧酶富集γ-氨基丁酸的新研究

通过一系列实验对传统的直接法与"提酶法"富集米糠γ-氨基丁酸(GABA)进行了比较,结果表明提酶法进一步提高了GABA的产率并且成本几乎没有增加."提酶法"即采用米糠谷氨酸脱羧酶(GAD)粗酶液外加谷氨酸钠来富集GABA,产率达到3 789.1 mg/100 g米糠,在此条件下可进一步采用固定化酶的方法固定化GAD粗酶液中的GAD,从而不仅很大程度上提高GAD的利用率,更方便了后期GABA的纯化工作,适合工业化生产要求.     

微生物谷氨酸脱羧酶研究进展

文章综述了谷氨酸脱羧酶的研究概况,包括微生物来源及分布、在微生物中的作用、酶学特性、酶的结构及基因工程,并对其研究前景进行了展望。     

南瓜谷氨酸脱羧酶酶学特性及γ-氨基丁酸富集条件

对生鲜南瓜(Cucurbita moschata)所含谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)的最适反应温度、最适pH、热稳定性和冷冻稳定性等酶学特性进行研究,并利用其富集γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA),探索了反应时间、南瓜品种、缓冲体系、南瓜及味精添加量、料水比对富集效果的影响。结果表明,南瓜GAD最适反应温度为30~35 ℃,最适pH为5.8。南瓜GAD对热比较敏感,50 ℃保温30 min,酶活力损失20%,70 ℃以上保温30 min可导致酶活力完全丧失。冷冻对GAD影响较小,但长期冷冻仍会导致酶活力损失,冷冻8周酶活力损失36%。GABA最适富集条件为:以pH5.8,0.2 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为反应溶液,南瓜与缓冲液比例为1:3,南瓜添加量25%,味精添加量1.5%,30 ℃反应18 h,反应液中GABA浓度可达7633.2 mg/L,转化率为93.3%,单位质量南瓜GABA富集量为30.5 mg/g,与未富集时相比提高了132倍。     

麦胚富集γ-氨基丁酸的培养条件优化

采用水浴保温的方法对麦胚中γ-氨基丁酸（GABA）进行富集,研究了培养温度、时间、液料比和培养液pH对麦胚中GABA含量和谷氨酸脱羧酶（GAD）活性的影响,采用响应面法对麦胚富集GABA的培养条件进行了优化。结果表明,在一定范围内培养温度、时间、液料比和培养液pH可有效提高麦胚中GAD活性,促进GABA积累。Box-Behnken实验结果显示,麦胚富集GABA的最优培养条件为培养温度46℃,时间1.5h,液料比6∶1（mL/g）,培养液pH4.6。在此培养条件下,麦胚中GABA最大富集量为36.78mg/g,是麦胚原料的5.51倍。方差分析表明,所建的回归模型能够很好的预测麦胚中GABA富集量的变化。      

表达谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建及其发酵条件的优化

谷氨酸脱羧酶（GAD）是生物合成γ-氨基丁酸（GABA）的关键酶,本研究通过基因工程构建了一株产GAD的重组枯草芽孢杆菌,并对其产GAD的发酵条件进行优化。分别通过单因素法、正交实验、极差分析和响应面法确定了最佳培养基成分（g/L）及发酵条件为:蔗糖23.5,豆粕10、乙酸铵为8.5、磷酸二氢钾4.1、七水硫酸镁0.5,p H7.0,培养温度37℃。在优化条件下GAD酶活达到0.413 U/m L,与优化前的GAD酶活0.143 U/m L相比,酶活提高了188.8%。本研究有助于后续开发枯草杆菌生产γ-氨基丁酸的工艺,以克服现在γ-氨基丁酸生产工艺中,大肠杆菌安全性的问题和乳酸菌成本过高的问题。      

生物合成γ—氨基丁酸工艺条件的优化

为了建立L-谷氨酸与γ-氨基丁酸（GABA）之间的转化关系,采用二次回归正交旋转组合设计方法对影响GABA生物合成的因素进行优化。建立了GABA生成量与底物浓度、温度、pH之间的数学模型;并确立了GABA制备的最佳工艺条件:底物浓度56.82mmoL/L、温度为40℃、pH为3.53。在此条件下,GABA的生成量达到0.84mg/mL。      

发芽糙米与稻谷的谷氨酸脱羧酶活力及γ-氨基丁酸含量比较

比较了糙米与稻谷发芽期间及培养结束后的静置过程中谷氨酸脱羧酶(GAD)活力、γ-氨基丁酸(GABA)及谷氨酸(Glu)含量变化情况。结果表明,糙米和稻谷在(32±1)℃条件下,以1.2 L/min的通气量,用含有0.1%L-谷氨酸、0.1%抗坏血酸的培养液浸渍发芽,生长速率和呼吸速率均以糙米为快。培养结束时,发芽糙米中GABA含量和Glu含量分别比发芽稻谷增加64.05%和14.68%,空气中放置8 h后发芽糙米中GABA含量比发芽结束时增加了24.32%,整个发芽和静置期间发芽糙米中GAD活力始终高于发芽稻谷。     

重组谷氨酸脱羧酶的表达条件优化、纯化及酶学性质研究

为了利用从γ-氨基丁酸（GABA）高产菌株——短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306中克隆并表达的谷氨酸脱羧酶进行GABA的生物制备,研究了影响重组工程菌E.coliBL21（pET28α（＋）-gad）生长的培养基组成和攸关GAD表达水平的诱导条件,优化了这些关键因素,提高了重组GAD的表达水平。采用Ni-NTA亲和纯化方法实现了对所得重组GAD的纯化,获得了纯酶,并确定了重组GAD产生GABA的最适pH值和温度,为该酶的工业应用创造了条件。     

发酵鸡肉肠中γ-氨基丁酸富集条件的优化

采用人工接种乳酸菌的方法,对发酵鸡肉肠中γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid,GABA)进行富集。首先鸡肉肠中分别添加不同来源的乳酸菌,筛选GABA富集的最佳发酵菌种;然后研究外源添加物L-谷氨酸(L-Glu)、VB_6和CaCl_2对鸡肉肠中GABA含量的影响,并采用Box-Behnken试验设计优化添加量。结果表明,3种不同来源的乳酸菌发酵鸡肉肠,其中酸奶乳酸菌与泡菜乳酸菌产GABA的能力较弱,均低于10 mg/100 g,耐久肠球菌产GABA能力最强,GABA含量达到62.14 mg/100 g,显著高于其他两种菌(P0.05);Box-Behnken设计得到发酵鸡肉肠富集GABA的最优外源添加物添加量为L-Glu 7.75 mg/100 g、VB_6 6.73 mg/100 g、Ca Cl2 8.35 mg/100 g,在此条件下鸡肉肠中GABA含量为68.32 mg/100 g,是未添加外源物含量的1.10倍,比普通鸡肉肠约提高10倍。方差分析表明,所建的回归模型能够很好地预测鸡肉肠中GABA含量的变化。其中,3种外源添加物的添加量均极显著影响鸡肉肠中GABA含量(P0.01),L-Glu和VB_6添加量的交互作用以及L-Glu和CaCl_2添加量的交互作用均显著影响鸡肉肠GABA含量(P0.05)。     

γ-氨基丁酸的生理功能和研究开发进展

文章对γ-氨基丁酸的生理功能及其研究开发进展进行了综述，并对其研究前景进行了展望。     

乳酸菌细胞转化法制备γ-氨基丁酸的研究

在利用乳酸茵Lactococcus lactis 1.009细胞中的谷氨酸脱羧酶转化制备γ-氨基丁酸(GABA)的过程中,探讨了茵体浓度、缓冲液种类及浓度、转化时间、茵龄、磷酸吡哆醛添加量、底物添加方式等因素对GABA产量的影响.结果表明,细胞转化法制备GABA的最佳条件为:菌体浓度10g/L,茵龄14h,缓冲液为0.2mol/L pH4.7的醋酸缓冲液,PLP的添加量为0.Immol/L.通过多次分批添加谷氨酸,50℃下反应60h后,GABA的积累量可迭19.1g/L,转化率为99.9%.     

乳酸菌细胞转化法制备γ-氨基丁酸的研究

在利用乳酸菌Lactococcus lactis1.009细胞中的谷氨酸脱羧酶转化制备γ-氨基丁酸（GABA）的过程中,探讨了菌体浓度、缓冲液种类及浓度、转化时间、菌龄、磷酸吡哆醛添加量、底物添加方式等因素对GABA产量的影响。结果表明,细胞转化法制备GABA的最佳条件为:菌体浓度10g/L,菌龄14h,缓冲液为0.2mol/L pH4.7的醋酸缓冲液,PLP的添加量为0.1mmol/L。通过多次分批添加谷氨酸,50℃下反应60h后,GABA的积累量可达19.1g/L,转化率为99.9%。      

产谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建与食品级表达

谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物合成γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶。本研究构建了4株无抗标记的重组枯草芽孢杆菌,首次实现了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis IL 1403)来源的谷氨酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的食品级表达。通过比较4株重组枯草芽孢杆菌的生长曲线和发酵酶活曲线,筛选出产酶效率最高的重组菌株B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal,该重组菌在初始发酵培养基中发酵42 h后发酵酶活可达4.1 U/mL。通过调整培养基成分,重组菌B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal的发酵酶活最高达到7.4 U/mL,与初始相比酶活提高了79%,是目前已报道重组枯草芽孢杆菌产谷氨酸脱羧酶酶活的最高水平。     

谷氨酸脱羧酶活力测定中GABA比色定量方法研究

建立了谷氨酸脱羧酶活力测定中γ-氨基丁酸比色测定方法,该方法灵敏度高、精确性和重现性好。测定程序为:取酶反应液0.4ml,加入Na2CO3(1mol/L)0.1ml、pH10.0硼酸盐缓冲液(0.2mol/L)0.5ml、6%苯酚1ml,混匀,于室温下(20℃)在5min内加入5.2%NaClO溶液1ml,混匀后放置4～8min,然后沸水浴l0min,立即冰浴20min,待溶液出现蓝绿色后,加入2.0ml60%乙醇溶液,混匀后于20℃水浴中放置20～40min,测定640nm处的吸收值。经采用比色法和高效液相色谱法对谷氨酸脱羧酶酶反应液进行测定,两种方法的测定结果相对误差为4.91%。     

谷氨酸脱羧酶发酵工艺的优化

用大肠杆菌AS1.505进行液态发酵生产谷氨酸脱羧酶并优化培养基,考察了碳源、氮源、复合营养物质、起始pH及发酵时间对酶活的影响,确定最佳产酶培养基组成为:葡萄糖1.0 g/dL,蛋白胨3.0 g/dL,氯化钠0.3 g/dL,磷酸氢二钾0.1 g/dL,硫酸镁0.02 g/dL,L-谷氨酸0.01g/dL,玉米浆1.5 g/dL,生物素30 t,g/L,麸皮4 g/dL;pH 6.5.在此基础上,设计发酵条件的优化实验.实验结果表明为:250 mL的三角瓶装液量25 mL,37℃,起始pH 6.5,培养18 h达到产酶高峰,产酶活力可达1 290 U/mL.     

嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶基因及其侧翼区序列分析

从嗜热链球菌Streptococcus thermophilus Y-2的谷氨酸脱羧酶基因(gadB)及其两侧旁邻序列出发,在GenBank中分别用Blastn、Blastx 搜索同源序列。gadB 在核酸水平上无法找到同源序列,在蛋白质水平上与多种细菌的谷氨酸脱羧酶同源。根据谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列构建系统发育树,菌株Y-2 与具核梭杆菌Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 的亲缘关系最近。gadB 的上游侧翼区与嗜热链球菌LMG 18311 的插入序列IS1216转座酶基因具有很高的相似性。gadB 的下游侧翼区在核酸水平上未找到同源序列,在蛋白质水平上与谷氨酸/γ- 氨基丁酸转运蛋白有很高的相似性。菌株Y-2 的gadB、gadC 排列方式与大肠杆菌、弗氏志贺菌的相同,而与乳酸乳球菌、短小乳杆菌的相反。在已完成全基因组测序的3 个模式株Streptococcus thermophilus LMG 18311、CNRZ1066、LMD-9 中均含有插入序列 IS1216,但未发现谷氨酸脱羧酶基因gadB、谷氨酸/γ- 氨基丁酸转运蛋白基因gadC。     

1 株产γ-氨基丁酸植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

以1 株产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BC114谷氨酸脱羧酶为研究对象,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术获得该酶基因,对其进行生物信息学分析,并转入大肠杆菌BL21（DE3）中实现异源表达。采用实时荧光定量PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分别测定重组菌不同发酵时间点谷氨酸脱羧酶基因的表达量、蛋白表达量以及产GABA能力。结果表明：植物乳杆菌中谷氨酸脱羧酶基因大小为1?410?bp,编码469?个氨基酸,蛋白二级结构由α-螺旋（32.2%）、β-折叠（11.5%）和无规则卷曲（56.3%）构成,完成了该酶的三维结构同源建模;成功构建了重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌,谷氨酸脱羧酶基因在诱导6?h相对表达量最大,而蛋白表达量较基因在转录水平表达量有一定滞后,在8?h达最大值,此时GABA产量也达最高,为2?387?mg/L。     

发芽糙米γ-氨基丁酸形成的谷氨酸脱羧酶活性与底物变化的相关性分析

以糙米为原料,采用浸泡发芽结合超声波逆境处理方式增加糙米中γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）含量。对发芽过程中谷氨酸（glutamic acid,GA）含量、谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase,GAD）活性及GABA含量进行分析,研究GA含量、GAD活性与GABA含量之间的关系。结果表明：随着发芽时间延长,GABA及GA含量持续明显增加,且GABA与GA含量有显著相关性（P＜0.05）。随着发芽时间延长,GAD活性呈先增后降再增的趋势;在发芽0～48?h之间,对照组GAD活性（以GABA量计）均值为9.25?nmol/g,GABA含量增加到6?倍以上;在48～60?h之间,GABA增量不明显。与对照相比,超声波处理促进GA含量增加2?倍以上,并且快速提高GAD活性,在36?h时发芽糙米中GABA含量最高达41.85?mg/100?g。     

乳酸菌谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究

本文对一株乳酸菌所产谷氨酸脱羧酶的酶学性质进行了较系统的研究,其中包括酶的热稳定性、pH稳定性及温度、pH和一些化学物质对酶活的影响。结果表明:此酶的最适温度为52℃,最适pH为4.5,米氏常数Km=24mmol。PLP、VB6及Ca2 在一定程度上都能促进酶活,且在含量小于100μmol时,作用程度为PLP>VB6>Ca2 。乙酸浓度小于0.05mol/L也能提高酶活力。