D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。     

α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

α-淀粉酶基因经改造后,克隆到穿梭质粒pBE2中。在α-淀粉酶基因的上游连接枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR),构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,转化蛋白酶三缺陷枯草芽孢杆菌菌株DB403。含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外,表明sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR)能很好的将枯草芽孢杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性及生物学活性。     

嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及酶学性质

首先根据Thermopolyspora flexuosa的内切-1,4-β-木聚糖酶基因设计了引物,PCR扩增成功后进行酶切消化,连接载体质粒pHT43,经大肠杆菌DH5α扩增后,挑选阳性克隆,经菌体PCR及测序验证后,将基因序列测序正确的质粒大量抽提,经过转化导入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilius WB800N宿主,培养并经过1 mmol/L IPTG诱导表达后,发酵胞外上清经SDS-PAGE电泳证明重组蛋白质成功获得表达。其相对分子质量为27 kD,最适反应温度为80℃,最适反应pH为6.0。由此得知,分泌表达的嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶的枯草芽孢杆菌工程菌株构建成功,这为未来该酶的产业化生产奠定了基础。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

为探索极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WB600）中的高效分泌表达条件,对来源于枯草芽孢杆菌的9?种Sec分泌途径信号肽进行筛选,结果显示信号肽YfkN的引导分泌效率最高。在此基础上,为进一步优化PFA的分泌表达,对信号肽YfkN的Ile3和Gln4进行饱和突变,并比较不同突变体的引导分泌效率。结果表明突变体I3G/Q4R的引导分泌效率最高,重组枯草芽孢杆菌的胞外α-淀粉酶活力高达715?U/mL。重组α-淀粉酶PFA的最适反应pH值为5.0,最适反应温度为100?℃,于100?℃的半衰期长达13?h,并且不依赖于Ca2＋。结果表明,采用信号肽I3G/Q4R,极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达,这有利于其在淀粉液化工艺中的应用。     

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

酸性α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现酸性α-淀粉酶基因的高效表达,将本实验室已经克隆得到的去信号肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌WB600宿主中进行表达,成功的构建了表达菌株pHT43-amy/WB600。在初始菌浓度OD600为0.8时加入终浓度为0.9 mmol/L的IPTG,诱导6 h的条件下测得酶活力为1 230 U/mL,又由于宿主菌WB600外分泌蛋白较少,因此具有明显的生产优势。     

α-淀粉酶在不同地衣芽孢杆菌宿主菌中分泌表达的对比分析

研究不同地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主菌对α-淀粉酶分泌表达的影响。以Bacillus subtilis的P43启动子,B.licheniformis WX-02α-淀粉酶基因的信号肽、编码区和终止子序列为表达原件,构建了α-淀粉酶分泌表达载体pP43SAT。将pP43SAT分别转入3株B.licheniformis宿主菌:WX-02(ΔamyL)、BL9和BL10,获得3株α-淀粉酶基因工程菌WX-02(ΔamyL,pP43SAT)、BL9(pP43SAT)和BL10(pP43SAT),并将构建的3株工程菌进行发酵对比分析。BL9(pP43SAT)和BL10(pP43SAT)的淀粉酶发酵活力分别达到94.01 U/mL和101.94 U/mL,比原始宿主菌WX-02(ΔamyL,pP43SAT)分别提高了21%和31%,这说明BL9和BL10新型宿主菌有利于淀粉酶的分泌表达。本研究证明多蛋白酶基因缺失可显著提高α-淀粉酶的表达,为α-淀粉酶的高效表达提供了新型宿主菌和新策略。     

重组枯草芽孢杆菌PaE菌株的构建及碳代谢阻遏效应研究

通过基因重组的方法,将枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶基因amyE（除掉启动子）整合在Paxo1质粒上,然后将重组表达质粒Paxo1-amyE导入枯草芽孢杆菌168菌株基因组中的半乳糖苷酶基因lacZ位点。通过转化筛选和重组基因分析,获得含有重组α-淀粉酶基因的工程菌株PaE。经过添加4 种不同的碳源发酵实验检测,在外加2 g/100 mL木糖诱导的情况下,重组菌株的α-淀粉酶产量均有增加。而且重组菌株在一定程度上能够克服葡萄糖等还原性糖引起的碳代谢阻遏现象,提高了α-淀粉酶产量。     

一种中性普鲁兰酶的高效表达及重组酶在粉丝制作中的应用

为获得适合粉丝制作工艺的普鲁兰酶,研究了嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)普鲁兰酶基因Gs P在不同枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)宿主菌中的表达及重组酶的应用效果。分别以淀粉酶基因缺失的枯草芽孢杆菌1A717和蛋白酶基因缺失的菌株WB600为宿主菌,构建了表达Gs P的重组菌,酶活检测和SDS-PAGE分析表明,两种重组菌产生的普鲁兰酶均为胞外酶,分别命名为Gs P1a和Gs Pwb。两种重组酶分别用于粉丝制作,以Gs P1a处理的芡糊制作的粉丝成品断条率接近于0,由Gs Pwb处理的芡糊制作的粉丝断条率高于前者,这可能与宿主菌WB600在发酵过程中产生的α-淀粉酶有关。该研究表明,中性普鲁兰酶是粉丝制作中明矾的理想替代物,酶液中α-淀粉酶活性的去除有利于其应用性能的提升。     

土壤宏基因组中芽孢杆菌信号肽的克隆及分析

从土壤宏基因组中筛选获得在芽孢杆菌中高效分泌重组蛋白的信号肽。通过数据分析,将预测到的信号肽DNA片段与蛋白酶基因融合,在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB800和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DL6中表达,进行胞外蛋白酶酶活测定。筛选得到25个可能来源于G+菌的信号肽序列,胞外蛋白酶活性分析的结果显示,有14个信号肽具有较好的分泌蛋白酶的能力,其中引导效果最好的信号肽（sig20）是蛋白酶自身信号肽的1.64倍。将高分泌信号肽转化到地衣芽孢杆菌中,证实其在地衣芽孢杆菌同样具有较好的引导效果。应用生物信息学与宏基因组学相结合的方法,可有效获得高效的芽孢杆菌信号肽序列,为蛋白质高效分泌表达系统的构建提供丰富的表达元件。     

通过串联启动子实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

本研究通过串联启动子方式实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800中的高效分泌表达。通过对几种现有报道的强启动子的比较并对其进行串联操作,确定生产纳豆激酶的最优启动子及纳豆激酶的最高产量。本研究首先在枯草芽孢杆菌WB800中成功构建五种含不同强启动子的重组质粒p SG101(P_(HpaII)),p SG102(PBcapr E),p SG103(Plux S),p SG104(Pgsi B)和p SG105(Pyxi E),实现纳豆激酶分泌表达,并对其纤溶活性进行测定。结果表明,启动子P_(HpaII)介导的纳豆激酶纤溶活性(110.80 FU/m L)明显优于其他四种启动子。通过对启动子P_(HpaII)进行多次串联,成功构建质粒p SG106(P_(HpaII)-P_(HpaII)),p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))和p SG108(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))。数据显示,菌株Bacillus subtilis WB800/p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))纳豆激酶产量最高为213.30 FU/m L,相比单个启动子P_(HpaII),提高了92.51%。通过对五种强启动子的比较以及对其进行串联操作,成功实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800的高效表达,纤溶活性最高为213.30 FU/m L,与现有相关报道相比有明显优势。     

木聚糖酶xynZF-318在枯草芽孢杆菌WB600中的表达及发酵条件优化

为了获得产木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌,本研究将木聚糖酶基因xynZF-318与高表达载体pWB980连接,获得重组载体pWB980/xynZF-318,并将其通过电击转化的方法导入枯草芽孢杆菌感受态细胞WB600,获得重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318。采用单因素及响应面法对该工程菌进行摇瓶发酵工艺优化。结果表明:重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318最优的发酵条件为:接种量为1.2%、装液量为20 mL、种龄为11 h、培养温度为37 ℃、摇床转速为160 r/min、发酵时间为168 h。验证后实际酶活力为0.359 U/mL,与野生株WB600相比酶活提高了2.66倍。本研究成功构建了产木聚糖酶的枯草芽孢杆菌工程菌,有望为木聚糖酶的工业应用尤其是食品工业应用提供新思路。     

助朋基因在Bacillus subtilisWB800中的克隆表达

对源自Bacillus subtilis168的具有纤溶活性的基因序列（WprA）进行克隆,然后将wpra基因克隆到大肠杆菌．枯草杆菌穿悛载体pBE3中,构建表达载体pBE-WprA,将重组载体转化到Bacillus subtilisWB800中,实现了WprA基因在Bacillus subtilisWB800中的表达。结果表明,WprA基因在Bacillus subtilisWB800中的对数生长期和平衡期均获得了表达,且产物被分泌到胞外。     

产谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建与食品级表达

谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物合成γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶。本研究构建了4株无抗标记的重组枯草芽孢杆菌,首次实现了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis IL 1403)来源的谷氨酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的食品级表达。通过比较4株重组枯草芽孢杆菌的生长曲线和发酵酶活曲线,筛选出产酶效率最高的重组菌株B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal,该重组菌在初始发酵培养基中发酵42 h后发酵酶活可达4.1 U/mL。通过调整培养基成分,重组菌B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal的发酵酶活最高达到7.4 U/mL,与初始相比酶活提高了79%,是目前已报道重组枯草芽孢杆菌产谷氨酸脱羧酶酶活的最高水平。     

转谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌WB800中的表达

以茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)基因组 DNA 为模板,PCR扩增得到转谷氨酰胺酶酶原基因(pro-transglutaminase,pro-TG),经pMD18-T载体亚克隆到表达载pBEp43(+),然后转化到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WB800中,经过32...     

重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

普鲁兰酶可特异性地水解支链淀粉得到直链淀粉,因而在淀粉加工过程中具有重要的应用。本研究从Bacillus naganoensis ATCC53909基因组中克隆了普鲁兰酶基因pul,并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体p BE中,构建表达载体p BE-pul。在此基础上,将来源于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的17个高表达基因的启动子分别克隆到表达载体p BE-pul中,并转化至Bacillus subtilis ATCC6051?10,成功构建了十七株含有不同启动子介导普鲁兰酶分泌表达的重组菌株。对重组菌株的分泌表达比较发现,启动子P43和Pspov G介导的普鲁兰酶活性明显优于其他启动子,其中Pspov G介导的普鲁兰酶活性更高。同时,还使用了启动子Pspov G介导N端的108个氨基酸缺失的pul324突变体进行分泌表达。通过对17种启动子的比较和两个普鲁兰酶基因的比较,本研究构建的一株重组菌株的普鲁兰酶的表达更为高效,其活性高达389.85 U/mL,后者显著高于现有的相关报道。