Ras信号通路阻断剂FTI-277抑制HeLa细胞增殖及对cyclin E表达的影响

目的：观察Ras信号通路阻断剂（FTI-277）在人类宫颈癌细胞株HeLa细胞中对细胞周期素E（cyclin E）表达及对HeLa增殖、凋亡的影响情况。方法：采用MTT法观察不同浓度的FTI-277对HeLa细胞的生长抑制作用;流式细胞术（FCM）观察Hela细胞的细胞周期变化;RT-PCR、Western blot法检测FTI-277阻断Ras信号通路前后HeLa细胞cyclin E mRNA及蛋白表达。结果：各浓度范围FTI-277均能抑制HeLa细胞的增殖,且具有剂量依赖性和时间依赖性。流式细胞术分析显示,FTI-277作用后的HeLa细胞明显滞留于G1/S期,且具有时间依赖性。RT-PCR及Western blot结果显示,FTI-277作用前后HeLa细胞cyclin E mRNA表达无明显变化,而蛋白表达水平明显降低。结论：FTI-277可以抑制细胞增殖,Ras信号转导通路可能是通过影响HeLa细胞cyclin E转录后的翻译环节减少其表达。     

慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的实验研究

目的：观察慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的有效性及对细胞活性的影响。方法：转染组用慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白（Lentivirus-enhanced green fluorescent proteins,Lenti-EGFP）转染细胞,对照组则加入空白培养液,在不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）及感染后不同时间段在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况并计算转染率;RT-PCR检测EGFP mRNA的表达;MTT比色法和流式细胞技术（Flow cytometer,FCM）检测病毒对细胞增殖和凋亡的影响。结果：Lenti-EGFP转染细胞后从48h开始可见绿色荧光,在MOI=500时,转染后第5天转染率可达51%;RT-PCR检测转染组有EGFP的mRNA表达;MTT结果显示在MOI为1~500时,漫病毒不影响细胞的增殖;在MOI=500时,FCM检测慢病毒载体对细胞凋亡无影响。结论：慢病毒载体可以在体外稳定有效转染兔角膜基质细胞且不影响细胞活性,是角膜基质细胞理想的基因转染载体。     

硝酸甘油对体外培养三叉神经节星形胶质细胞的损伤作用

目的：硝酸甘油（glyceryl trinitrate或nitroglycerin,GTN）对于体外培养的三叉神经节星形胶质细胞损伤作用,为偏头痛发病机制研究提供依据。方法：体外纯化培养大鼠三叉神经节星形胶质细胞,采用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光法鉴定。不同浓度的硝酸甘油作用于星形胶质细胞后,应用Alarm blue检测细胞活力,并筛选出可以影响细胞活力的适宜刺激的浓度;适宜刺激后用Fluo-3AM为细胞内钙离子荧光指示剂,激光共聚焦显微镜测定各组星型胶质细胞内钙离子浓度的变化;RT-PCR检测IL-1β、TNF-αmRNA表达。结果：GFAP免疫荧光法显示培养的星型胶质细胞阳性率达95%左右;0.55mmol/L、1.1mmol/L和2.2mmol/L三种浓度硝酸甘油刺激星型胶质细胞后活力明显降低（P〈0.05）,但从细胞活力和形态上观察0.55mmol/L硝酸甘油刺激最佳;0.55mmol/L硝酸甘油刺激后细胞内钙略降低,IL-1β、TNF-αmRNA表达增高（P〈0.05）。结论：硝酸甘油对于体外培养的星型胶质细胞有明显的损伤作用,其机制可能与炎症因子相关。     

ALA-PDT结合TGF-β1基因转染对结肠癌细胞抑制作用的研究

目的：探讨ALA—PDT结合hTGF—β1基因转染对结肠癌细胞体外增殖的抑制作用。方法：以腺病毒为载体将hTGF-β1基因导入人结肠癌细胞株8W480后,行PDT处理,应用免疫组化法检测TGF—β1的表达情况。通过MTT法检测转染后细胞增殖的抑制情况。应用流式细胞技术榆测细胞周期的变化。结果：转染hTGF—β1基因后,TGF—β1蛋白表达明显增强。与单纯行PDT相比,C0／S周期阻滞作用更为明显。对SW480的增殖抑制效果明显提高（p＜0．05）。结论：转染hTGF—β1基因可明显增强ALA-PDT对体外培养的结肠癌细胞SW480的增殖抑制作用。     

兔声带成纤维细胞的体外分离培养、鉴定与标记

目的探讨体外培养兔声带成纤维细胞(Vocal Fold Fibroblasts,VFFs)的培养及标记方法。方法消化培养法分离、培养兔声带成纤维细胞,倒置显微镜观察其生长和形态特征,并传代、鉴定。增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体(Ad-EGFP)标记体外培养的VFFs,取12只新西兰兔,以1×100万/0.1ml分别注入损伤模型左侧声带,观察注入VFFs的生长情况。结果兔声带成纤维细胞可以在体外原代和传代培养,具有成纤维细胞的典型形态。波形蛋白免疫荧光染色阳性,Ad-EFGP可以成功转染VFFs。将VFFs诸如声带后15d,组织学切片未发现成活细胞。结论用消化培养法可成功获得VFFs,Ad-EGFP是一种理想的示踪标记物。     

以叶酸受体为靶向的脂质体介导MYCN基因小干扰RNA体外抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞的增殖

目的以氨基脂为主要成分、叶酸受体为靶向的脂质体包裹MYCN基因小干扰性RNA,研究其体外对神经母细胞瘤LA-N-5细胞MYCN基因表达的抑制及细胞增殖的影响。方法制备氨基脂为主要成分、叶酸受体为靶向的脂质体包裹CY3标记的MYCNsiRNA转染LA-N-5细胞,以每微克蛋白中荧光强度半定量siRNA的转染效果;用定量RT-PCR检测转染前后MYCN基因mRNA变化;MTT法检测细胞增殖受抑情况：结果以100nmol／L终浓度转染LA—N-5细胞后每微克蛋白含siRNA（1808．5±140．2）pg,作用72hMYCN基因mRNA表达显著下降,抑制率79．2％,瘤细胞增殖受抑达66．2％。结论叶酸受体为靶向脂质体介导MYCNsiRNA在体外对LA—N-5细胞MYCNmRNA表达有显著抑制作用,明显抑制LA—N-5细胞增殖,为神经母细胞瘤靶向治疗、基因治疗开辟了新的思路。     

反义核酸药物癌泰得对乳腺癌细胞株的体外杀伤作用

目的探讨反义核酸药物癌泰得对乳腺癌细胞株的体外杀伤作用。方法1)MTT法测定不同浓度癌泰得对乳腺癌细胞株BT474的抑制率。2)Annexin/PI双染法,流式细胞仪检测细胞凋亡比率。结果MTT法观察到癌泰得对BT474细胞的杀伤作用,流式细胞仪检测到BT474细胞凋亡率达16.82%,以晚期凋亡为主。结论癌泰得对BT474细胞有抑制作用,抑制率与浓度呈线性相关。     

紫杉醇抑制原代培养人视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究

目的研究紫杉醇(Taxol)对体外原代培养人视网膜色素上皮(human Retinal Pigment Epithelium,hRPE)细胞增殖的抑制作用及机制。方法体外分离、原代培养hRPE细胞,采用免疫细胞化学方法对其进行鉴定。不同浓度紫杉醇(0、0.005、0.05、0.5、5mg/L)处理hRPE细胞一定时间,采用形态学观察、细胞生长曲线及MTT法检测药物对hRPE细胞的生长抑制效应,流式细胞术检测药物对hRPE细胞的细胞周期阻滞作用及凋亡诱导作用。结果原代培养的hRPE细胞胞浆富含色素,随传代次数增加,黑色素颗粒逐渐减少直至消失。用抗人细胞角蛋白抗体进行免疫细胞化学鉴定hRPE细胞呈特异的阳性反应。细胞生长曲线及MTT法显示:紫杉醇作用于hRPE细胞24h和72h,其抑制细胞生长增殖的IC50值分别为5.24和3.24mg/L。流式细胞分析术检测结果显示:0.5mg/L紫衫醇作用细胞48h即可显著延迟hRPE细胞G2/M期进展并诱导凋亡(P<0.05)。透射电镜观察显示:0.5mg/L紫杉醇作用后细胞表面微绒毛减少,电子密度增加,细胞器减少,异染色质聚集成团、边聚等。结论紫杉醇通过阻滞G2/M期进展...     

细胞增殖状态对激光诱导血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的：探讨细胞的增殖状态及细胞周期分布对体外培养的血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡的激光诱导率的影响。方法：组织贴块法体外培养VSMC,饥饿法同步法,VSMC在不同的刺激因子作用之后,亚甲基噻唑蓝比色（MTT）法检测细胞增殖状况,流式细胞仪（FCM）检测细胞的周期发布,510．6nm的铜蒸汽激光照射后,TUNEL染色法记数细胞凋亡率。结果：生长活跃,处于增殖期的细胞,在激光的诱导下易发生凋亡;相反,增殖相对不活跃、处于静止期的细胞,凋亡诱导率较低。结论：经不同生长因子刺激后VSMC的增殖状态及细胞的周期分布不同,对激光的凋亡诱导率产生影响。     

增强型绿色荧光蛋白基因转染对原代培养的人成纤维细胞细胞周期的影响

目的:观察转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因后对原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞周期的变化,建立原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞的示踪方法.方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,采用电转仪将pEGFP-N1质粒转入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,应用荧光显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况,流式细胞仪检测其转染效率和细胞周期的变化.结果:增强型绿色荧光蛋白基因在转染24h后得到了明显表达,48h后流式细胞仪检测其表达率为32.6%,细胞周期无明显的变化,且未影响成纤维细胞的贴壁过程.结论:经pEGFP-N1质粒转染的原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞仍能在体外存活,对成纤维细胞的生长没有明显的影响.pEGFP-N1是转染原代培养的人成纤维细胞较为理想的瞬时表达载体,是研究成纤维细胞生物学行为的良好示踪剂.     

氯胺酮对He-Ne激光照射促人正常皮肤成纤维细胞增殖作用的影响

针对动物模型伤口的光生物调节作用，用He-Xe激光对人正常皮肤成纤维细胞增殖的促进作用作为细胞模型．研究了麻醉药氯胺酮的影响。用MTT法测定细胞增殖作用。分别研究了1．56mW／cm^2He—Ne激光(0，10，30，100和300s照射)对人正常皮肤成纤维细胞的增殖作用和氯胺酮(0，0．6，1．2和2．0μg／mL)预处理划He—Ne激光(300s照射)细胞增殖作用的影响。氯胺酮(0．6，1．2,2．0μg/mL)预处理能抑制468．7mJ／cm^2He—Ne激光促人正常皮肤成纤维细胞增殖的作用。这说明动物实验中用于麻醉的药物可能对激光促进伤口愈合的实验结果有影响。     

活性真皮基质的研制及生物学活性检测

目的构建含有成纤维细胞（Fb）-胶原-猪去细胞真皮基质（PADM）的活性真皮基质。研究培养液中转化生长因子-β1（TGF-β1）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的分泌情况。方法将Fb与胶原混合种植于PADM的表面，收集第2、4、6、8、10d培养液样本，双抗体夹心ELISA法测定其中TGF-β1、bFGF的含量。结果Fb在胶原内结构完整，与PADM形成复合真皮基质。TGF-β1和bFGF浓度培养第4天与第2天比较显著上升（P〈0．01），并达到稳定水平。结论Fb-胶原-PADM真皮替代物可作为构建组织工程全层皮肤的真皮支架。     

扇贝多肽减轻中波紫外线诱导人真皮成纤维细胞损伤的超微结构研究

目的：观察扇贝多肽(polypeptide from Chlamys farreri,PCF)对中波紫外线(ultraviolet B,UVB)辐射损伤体外培养的人真皮成纤维细胞超微结构的影响。方法：建立单次UVB辐射损伤体外培养的人真皮成纤维细胞的病理模型,应用透射电镜观察细胞超微结构的变化。结果：模型组成纤维细胞超微结构在2h后即出现变化．包括胞内空泡形成、线粒体嵴断裂、基质空泡化、粗面内质网扩张、核异染色质浓缩及边集,呈现早期细胞凋亡改变。而用0．25％～l％的PCF预处理细胞30min,可减轻成纤维细胞受损的程度,且呈量效关系。结论：扇贝多肽可有效地保护人真皮成纤维细胞对抗UVB的辐射损伤。     

Nd:YAG激光照射对培养癜痕疙瘩成纤维细胞凋亡相关基因表达的影响

目的：探讨Nd：YAG激光诱导癜痕疙瘩成纤维细胞凋亡的机制。方法：以波长1064nm、功率密度100mW／cm^2的Nd：YAG激光照射培养瘢痕疙瘩成纤维细胞,采用流式细胞仪测定细胞凋亡和Bcl-2,P53和survivin蛋白的表达。结果：在培养增生性瘢痕成纤维细胞有Bcl-2,P53和survivin蛋白低表达,Nd：YAG激光照射后,Bcl-2和survivin表达降低,P53的表达无变化。结论：Nd：YAG激光诱导的瘢痕成纤维细胞凋亡与Bcl-2和survivin表达蛋白有关。     

人参皂甙Rb1促进老年大鼠睾丸间质细胞睾酮产生和StAR蛋白表达

目的:探讨人参皂甙Rb1对老年大鼠间质细胞增殖及睾酮产生的影响,分析人参皂甙Rb1对睾酮提升作用的机制.方法:体外分离培养老年大鼠睾丸间质细胞,培养液中分别加入不同浓度RB1,MTT法测定细胞增殖改变,ELISA法测定培养上清中睾酮水平,用RT-PCR分析间质细胞StAR基因和P450scc基因表达,western b...     

ALA-PDT后结肠癌细胞生长抑制及P21、cyclinD1、CDK2mRNA表达的研究

目的：探讨ALA-PDT对结肠癌细胞增殖抑制及以及对P21、cyclinnD1、CDK2的影响。方法：采用MTF法检测PDT后对细胞增殖抑制情况。应用RT-PCR技术检测细胞P21、cyclinD1、CDK2mRNA的含量。结果：PDT后P21mRNA含量较PDT前提高（P〈0．01），而cyclinD1、CDK2mRNA的含量下降（P〈0．01），SW480细胞出现明显的增殖抑制。结论：ALA-PDT对肿瘤细胞的增殖抑制作用与其诱导P21的过表达，进而下调cyclinD1、CDK2的表达有关。     

低强度超声对鼻咽癌CNE2细胞增值和凋亡的影响

目的：观察低强度超声对人鼻咽癌CNF2细胞增殖和凋亡的影响。方法：以低强度超声（频率1．7MHz,剂量1．35W／cm2）辐照CNF2细胞,采用MTT观察超声对COCl细胞增殖的抑制作用;光镜观察细胞形态,细胞核荧光染色法检测凋亡细胞。结果：超声波能够显著抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖,辐照后孵育18h,其MTT光吸收值与对照组相比监著降低：光镜下可见细胞形态学改变,同时Hoechst 33258荧光染色法观察到亮蓝色着染的凋亡细胞。结论：低强度超声辐照对人鼻咽癌CNE2细胞体外生长具有明显的抑制作用,并可诱导其凋亡。     

低能量激光照射对成骨细胞增殖中Hedgehog信号通路的作用

探讨低能量激光照射是否对体外培养的成骨细胞增殖过程中的hedgehog信号通路产生影响,揭示低能量激光照射促进骨形成的分子学机制,为其在口腔种植的临床应用提供理论依据。体外培养小鼠成骨样细胞系MC3T3-E1,用hedgehog信号通路增强剂N端hedgehog重组蛋白(N-Shh)、hedgehog信号通路抑制剂环巴胺对低能量激光照射后的MC3T3-E1进行干预,随机分为4组,采用细胞计数,MTS,流式细胞术检测照射后12,24,48,72h成骨细胞的增殖活性。结果显示,与激光照射组相比,激光照射+N-Shh组的细胞增殖活性明显增加,激光照射环巴胺组的细胞增殖活性明显降低,激光照射环巴胺组的细胞增殖活性仍高于对照组。研究发现低能量激光照射活化了成骨细胞增殖过程中的hedgehog信号通路,hedgehog信号通路是参与低能量激光照射调控成骨细胞增殖的通道之一。     

电穿孔法转染原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的条件优化

目的:通过电穿孔法将增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,探讨影响外源基因电转染效率的参数,如电压、脉冲长度、DNA剂量以及转染后时间长度等.方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,选择不同的电压梯度、脉冲长度及DNA剂量,采用电转仪将pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,用荧光显微镜观察转染后不同时间pEGFP-N1瞬时表达情况及细胞存活情况,流式细胞仪检测其转染效率.结果:在电压为250v、脉冲数1、脉冲长度15μs、DNA质粒6μg时,电穿孔法将pEGFP-N1质粒导入瘢痕疙瘩成纤维细胞转染率最高,细胞存活率最高,转染后24h明显表达,48h后表达最强.结论:在适当的电压、脉冲长度下,选择适当的DNA用量,在转染后一定的时间范围内,电穿孔法转染原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞可使目的基因获得较高的转染率,且细胞死亡最少.电穿孔法是研究原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为较为理想的转染方法.     

聚砜膜生物反应器实验系统对重肝患者血浆的影响

目的：了解聚砜膜生物反应器实验系统对重肝患者血浆的影响,探索聚砜膜中空纤维反应器作为生物人工肝反应器的可行性。方法：用磁力搅动法将分离的新生实验小型猪肝细胞进行球形体培养,接种到聚砜膜中空纤维反应器外腔,观察聚砜膜生物反应器实验系统对重肝患者血浆的血氨、胆红素、凝血酶原时间、TNF-α、TGF-β1的影响。结果：该实验系统能降低重肝患者血浆的血氨、胆红素,缩短凝血酶原时间,降低TNF-α、TGF-β1水平。结论：聚砜膜生物反应器实验系统能够清除重肝患者血浆中的小分子有毒物质,补充有益成分,降低细胞因子水平。