PRMT2慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)慢病毒表达载体。方法通过PCR扩增PRMT2 c DNA,将PRMT2 c DNA连接于GV308载体,经测序确认后,将GV308/PRMT2与p Helper 1.0和p Helper 2.0共转染至293T细胞中,收获病毒,通过Real time PCR测定滴度;将PRMT2慢病毒表达载体侵染293T细胞,通过四环素诱导和Western blot检测PRMT2慢病毒表达载体的表达能力。结果在感染PRMT2慢病毒载体293T细胞中能检测到PRMT2-3Flag融合蛋白的表达。结论成功构建PRMT2的慢病毒表达载体。     

S100A11慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的构建S100A11基因慢病毒表达载体,建立Huh-7 S100A11稳定细胞株,并鉴定其表达。方法 RT-PCR扩增S100A11基因片段,与pWPT载体经MluⅠ和NotⅠ同时酶切后连接,构建慢病毒表达载体pWPTS100A11;将表达载体pWPT-GFP和pWPT-S100A11与慢病毒包装质粒pMD2.G和psPAX2共同感染293T细胞,获得携带GFP和S100A11基因的慢病毒,将两种慢病毒分别感染Huh-7细胞,获得Huh-7 S100A11和Huh-7GFP稳定细胞株;利用Real-Time PCR和Western Blotting实验方法检测感染后S100A11的过表达情况。结果成功构建慢病毒表达载体pWPT-S100A11;慢病毒感染Huh-7细胞株后,阳性对照Huh-7GFP经荧光镜检测传染率达95%;感染Huh-7细胞后S100A11的mRNA和蛋白表达量均增加。结论成功构建慢病毒表达载体pWPT-S100A11,并建立了Huh-7 S100A11稳定细胞株,为进一步研究S100A11基因在肝癌中的生物学功能和机制奠定了基础。     

Pokemon表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建Pokemon表达慢病毒载体。方法通过PCR扩增Pokemon cDNA,将Pokemon cDNA连接于GV165载体,经测序确认后,将GV165/Pokemon与pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染至293T细胞中,收获病毒,通过Real time PCR测定滴度;将Pokemon表达慢病毒载体侵染293T细胞通过免疫荧光和Western blot检测Pokemon表达慢病毒载体的转染效率和Pokemon的表达能力。结果在感染Pokemon慢病毒载体293T细胞中能检查到Pokemon-GFP融合蛋白的表达。结论成功构建表达Pokemon的慢病毒载体。     

整合缺陷型重组慢病毒载体构建及HCV重组假型慢病毒颗粒的制备与性状分析

为提高慢病毒载体应用的安全性及改进HCV新型颗粒疫苗的制备,首先对传统的慢病毒三质粒系统进行改造:将包装质粒pHR’CMVΔR8.2改造成整合缺陷型的包装质粒pHR’CMVΔR8.2D64E,并在体外感染实验验证其整合缺陷性;将转移质粒中的报告基因GFP替换成HCV的NS3基因,选用表达3种亚型(1a、1b、2a)HCV包膜E1E2的包膜质粒,用改造后的三质粒系统制备了3种亚型(1a,1b,2a)的假型丙型肝炎病毒(HCV)整合缺陷型慢病毒颗粒,并用Western blot方法确定了颗粒上包膜蛋白的表达,通过电镜可观察到浓缩后的HCV慢病毒颗粒结构,HCV慢病毒颗粒感染Huh7细胞后可观察到转基因NS3的表达。为安全高效的慢病毒载体的应用及HCV假型颗粒疫苗研发提供了新的技术路线。     

LIMK1在结肠癌中表达与沉默对人结肠癌细胞迁移与侵袭的影响

目的探讨LIMK1在结肠癌中的表达与临床病理参数的关系和沉默LIMK1对人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭的影响。方法免疫组化检测LIMK1在结肠癌表达;RNA干扰建立LIMK1-miR/SW480细胞株;RTPCR与Western blot分别检测LIMK1 mNRA与蛋白及磷酸化LIMK1表达;划痕实验和侵袭实验检测沉默LIMK1对SW480细胞迁移与侵袭的影响。结果免疫组化显示,LIMK1在结肠癌中表达明显高于结肠正常组织,高分化腺癌表达明显低于中分化与低分化腺癌,而低分化高于中分化腺癌;<5.0 cm的结肠癌表达明显低于≥5.0 cm;淋巴结转移显著高于无转移;Dukes分期A+B组表达明显低于C+D组(P<0.05)。RT-PCR与Western blot显示,LIMK1-miR/SW480细胞LIMK1 mNRA与蛋白表达明显下调,表明成功构建稳定沉默LIMK1基因的SW480细胞。免疫细胞化学证实,沉默组LIMK1表达较未转染组与空载体组明显降低。Western blot显示,沉默组LIMK1和磷酸化LIMK1较未转染组与空载体组明显下调(P<0.05)。划痕实验显示,沉默组癌细胞迁移率(22.53%)较对照组(76.50%)与空载体组(72.14%)明显降低(P<0.05)。侵袭实验发现,沉默组穿膜细胞(43.67±1.51个)较未处理组(143.33±1.52个)与空载体组(136.34±1.53个)明显减少(P<0.05)。结论 LIMK1表达与结肠癌发生、大小、淋巴结转移及Dukes分期有关。沉默LIMK1基因可抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭。     

靶向ABCG2基因的RNA干扰提高K562细胞的化疗敏感性

目的:研究靶向人白血病K562细胞内高表达的三磷酸腺苷结合盒转运体G2(ATP binding cassette transporter G2,ABCG2)基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对K562细胞化疗敏感性的影响.方法:构建靶向ABCG2基因的RNAi重组腺病毒Ad-siABCG2,以其感染K562细胞后,采用RT-PCR、免疫细胞化学和Western印迹法检测K562细胞中ABCG2 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测K562细胞对药物的敏感性变化,FCM检测细胞内多柔比星(adriamycin,ADM)和柔红霉素(daunorubicin, DNR)的平均荧光强度.结果:成功构建靶向ABCG2的RNAi重组腺病毒Ad-siABCG2,经感染K562细胞后可有效沉默ABCG2基因表达;MTT检测发现,感染Ad-siABCG2的K562细胞对ADM和DNR的敏感性是未感染时的2～6倍(P＜0.01);FCM检测显示,感染Ad-siABCG2的K562细胞内DNR和ADM平均荧光强度(86.19和180.26)分别高于未感染的K562细胞(63.65和141.60),差异有统计学意义(P＜0.05).结论:重组腺病毒Ad-siABCG2沉默ABCG2基因表达可增加K562细胞对ADM和DNR的敏感性,表明ABCG2基因表达可导致K562细胞产生多药耐药;Ad-siABCG2对ABCG2介导的细胞多药耐药有逆转作用.     

RNA干扰NUP88基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长及侵袭力的影响

目的:构建重组慢病毒介导的NUP88-shRNA载体,通过RNAi技术分别观察沉默NUP88后对MCF-7增殖,粘附,侵袭和转移情况的影响,为乳腺癌的临床基因治疗寻找新的靶点。方法:构建NUP88重组慢病毒表达载体,包装后检测滴度,以最佳复感染指数转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR和Western blot检测各组MCF-7细胞中mRNA和蛋白的表达效率;MTT法和流式细胞仪检测法,检测NUP88基因被干扰后对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响;细胞侵袭实验检测NUP88基因被干扰后对MCF-7侵袭力的影响。结果四组病毒及一组阴性对照均构建成功,滴度均为4E+8TU/ml;RT-PCR和Western blot检测,结果表明:经NUP88-shRNA转染的MCF-7细胞组NUP88 mRNA和蛋白质的表达与经阴性转染组和空白MCF-7细胞组相比,差异明显具有统计学意义(P<0.01);测定NUP88-shRNA1组沉默效率最高,沉默率可达到86%;MTT法结果表明:实验组经NUP88-shRNA1慢病毒转染后细胞增殖程度显著减少,与空白组和对照组相比有显著性差异(P<0.05)。流式细胞仪检测三组MCF-7细胞凋亡结果表明:实验组经慢病毒转染后细胞凋亡率显著增加,与对照组和空白组相比有显著性差异(P<0.05);细胞侵袭实验表明:在肿瘤细胞常规培养24h后,实验组与空白组和阴性对照组比较,穿膜细胞数量明显减少,具有显著性差异(P<0.05)结论:NUP88重组慢病毒可以通过RNAi成功抑制MCF-7中NUP88基因的表达,并能显著抑制其增殖及远处的侵袭能力。     

PK-15细胞微载体悬浮培养生产猪细小病毒的工艺研究

通过对猪细小病毒接毒时间TOI、MOI和收毒时间进行优化,开发了一种基于PK-15细胞静置培养的猪细小病毒生产工艺,最大病毒滴度达到107.5TCID50/ml。通过进一步优化接毒时间,成功建立了基于PK-15细胞反应器微载体悬浮培养的猪细小病毒培养工艺,在5L反应器上最大病毒滴度达到107.2TCID50/ml。首次发现乳酸对葡萄糖得率与病毒滴度的正相关性,当猪细小病毒滴度处于最大值时,乳酸对葡萄糖得率也达到最大值,可作为指针病毒滴度及收毒时间的重要参数。     

慢病毒干扰AQP4促进脊髓损伤修复与其上调VDAC2相关性的研究

目的 采用慢病毒干扰水通道蛋白4(AQP4)的表达,观察电压依赖性阴离子通道2(VDAC2)在脊髓损伤后的表达变化,探讨VDAC2的差异性表达对脊髓损伤修复过程的影响。方法 将SD大鼠随机分为脊髓钝挫伤(SCC)组、假手术(Sham)组、AQP4慢病毒干扰(AQP4-SH-LV)组、空载(Vector)组。采用Allen’s法制备SCC模型;Gene MANIA生物信息学方法预测AQP4与VDAC2的关联;通过注射包装AQP4 siRNA的质粒,构建慢病毒干扰AQP4的SCC模型。BBB评分评价大鼠后肢的运动功能;HE染色显示脊髓组织损伤状况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定VDAC2 mRNA表达量;免疫组织化学染色(IHC)检测VDAC2定位及半定量情况。结果 1)BBB评分结果显示,脊髓钝挫伤后SCC组和Vector组得分显著降低,接近0分。AQP4-SH-LV组得分的下降趋势与Vector组相似,但各时间点评分均高于后者。HE染色结果显示脊髓顿挫伤后脊髓组织发生水肿,干扰AQP4后水肿程度有所减轻。2)qRT-PCR结果表明,与Sham组相比,SCC组各时间点VDAC2的mRNA转录水平降低(P<0.05);慢病毒干扰AQP4,SCC术后第7天,AQP4-SH-LV组体内VDAC2 mRNA转录水平较Vector组上调(P<0.05)。3)免疫组化结果显示:VDAC2免疫阳性产物主要分布于细胞质。SCC组各时间点VDAC2免疫阳性细胞数均低于Sham组(P<0.05);AQP4-SH-LV组各时间点VDAC2免疫阳性细胞数均高于Vector组。4) GeneMANIA结果显示,AQP4和VDAC2两分子间具有特定的生理联系,如共表达、共定位、共享蛋白质结构域等。结论脊髓损伤后,大鼠体内VDAC2的转录水平下降,不利于脊髓组织损伤后的恢复。慢病毒干扰AQP4可上调VDAC2转录水平,并促进脊髓损伤的修复。     

基于新课程改革下的小学教育管理

本文结合对我国新课程改革的过程的分析,找出目前小学教育管理存在的问题,就此问题提出新课程改革提高教学质量的措施。     

学校网络教学之我见

网络教学是教育信息化发展的必然趋势。在学校开展网络教学是非常必要的,它对现代教学模式产生重大的影响。开展网络教学的同时还需要关注一些问题。     

语用学与基础教育语文课程改革

基于语用学的建构,基础教育语文课程改革呈现出统一、有序、明晰、高瞻远瞩的格局,即以语用体验为核心,以话语为基本单位,将语言要素和规则层面的语形、语义和生活体验层面的个人状况、自然和社会情境,整合为"人—文语境"。经过"语境化",建构语文教学以及语文教学所涵盖的话语、说话者和听话者以及社会。     

婺源傩面具艺术特征及其文化艺术再现

傩面具是原始宗教观念和巫术艺术的物化形式,是中国千年民间艺术创作出来的艺术符号。傩面具由于地域的不同而呈现不同的艺术和文化特色。婺源傩面具以其夸张怪异的造型、沉稳和谐的色彩及神秘的文化功能体现了当地人的审美情趣,并且以各种形式再现了当地傩文化的艺术魅力。     

地下工程课程教学改革的思考和分析

地下工程是一门实践性很强的工程学科。地下工程课程是土木工程专业本科生的重要专业基础课之一。为满足中国日益发展的地下空间开发建设对土木工程人才的需求,其教学改革势在必行。在分析该课程教学特点的基础上,结合教学实践,提出了该课程教学改革的指导思想和具体措施。     

英国高等教育大发展时期的课程改革及启示

通过分析战后英国新教育思潮出现的背景,阐述了英国高等教育大发展时期课程改革的特点,并主要从其4种新型的办学模式所采用的课程设置方式,进一步揭示出了其对我国高等教育大众化进程中高校课程改革的有益经验。     

具有时滞增长反应和脉冲输入的Monod-Haldane恒化器竞争模型

通过应用脉冲时滞微分方程的相关理论和方法,研究一类具有时滞增长反应和脉冲输入营养基的Monod-Haldane型恒化器竞争模型,得到了微生物灭绝周期解全局吸引的充分条件。     

刍议思想政治教育理论课程改革——基于网络视角的高校入党积极分子教育视角

大学生入党积极分子思想政治教育是高校培养党的后备军和各项建设事业接班人的的重要阵地和主渠道,本文基于网络思想政治教育维度,从新时期高校大学生入党积极分子思想政治教育面临的新问题入手,简要分析并提出了通过网络加强大学生入党积极分子思想政治教育的几点对策。     

工程系统、工程教育与CDIO课程改革

长期以来,国内专家学者对于工程教育的研究大多停留在对教育政策和国外教育模式的初步解读上,对工程教育方面的定性研究较为有限。本文从工程教育起源出发,重点阐述了工程教育结构、课程体系及CDIO工程教育改革领域的系列核心问题。     

设计,教育的社会责任

帕森设计学院、社会研究新学院和奥本大学乡土工作室是美国三所著名的教学研究机构,本文概述了这三所院校的历史沿革、办学思想和教学方式,并以此论证了设计和教育的目的在于履行社会责任。作者进而通过评判、比较上海的发展前景和纽约“零地带”的重建得出结论。建筑师的社会责任在于创新,而创新的目的则是为了回应城市世代绵延的今古对话。