多肽配基亲和吸附介质的配基密度控制规律

以谷胱甘肽为配基,琼脂糖微球为骨架,探索将谷胱甘肽通过共价键偶联到琼脂糖微球骨架上,制备可以分离谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase, GST)及以其为标签的融合蛋白的亲和吸附介质.采用正交实验方法考察了谷胱甘肽加入量、偶联缓冲液的pH值和反应温度对亲和介质配基密度的影响.结果发现,该反应过程中的pH值对配基密度影响最大,其次为谷胱甘肽的加入量.用所制备的亲和吸附介质纯化GST(大鼠肝脏谷胱甘肽S转移酶),发现GST的吸附量随配基密度增加而增加,但GST活性却随配基密度的增加而下降,较好的干胶配基密度为260 μmol/g.大鼠肝匀浆液经过离子交换和亲和层析两个步骤,获得了电泳纯的GST,比活力为12.08 U/mg,总活性回收率为40%以上.     

席夫碱法制备大孔聚合物肝素亲和层析介质

肝素亲和层析介质因其专一性好、操作条件温和等特点,广泛应用于蛋白分离纯化,本工作以大孔聚丙烯酸酯微球为基质,肝素为配基,利用席夫碱法制备了肝素亲和层析介质。配基偶联经过三步完成,首先将大孔聚丙烯酸酯微球表面环氧基团通过0.5 mol/L H₂SO₄水解为邻羟基,然后将邻羟基氧化为醛基,最后利用醛基与肝素分子的胺基反应将肝素分子固定于微球表面。以溶菌酶为模型蛋白,主要考察了肝素偶联反应的各因素对蛋白结合容量的影响规律,包括肝素浓度、缓冲液pH及浓度、反应时间等,建立了最优偶联肝素配基的方法。所得亲和介质静态结合容量可达40.3 mg/mL,比商品GP-肝素介质高约36%,经1.0 mol/L的氯化钠洗脱,其蛋白回收率达到95%。通过扫描电子显微镜表征微球表面形貌,观察到偶联肝素后的微球仍能保持其大孔结构。考察了该类亲和介质在不同操作流速(31.8～318 cm/h)下的动态结合容量,发现操作流速提高10倍后介质结合容量仅下降12%。经10次重复使用后,动态结合容量仍可保持初始容量的81%。用于混合蛋白模型中分离乳铁蛋白,结果表明具有良好的分离效...     

交联壳聚糖微球纯化抑肽酶研究

采用反相悬浮法制备交联壳聚糖微球,共价偶联胰蛋白酶,制成抑肽酶亲和吸附剂,将其直接亲和层析牛肺粗提液,制备高比活抑肽酶。结果表明,制备的亲和吸附剂单位活力1270KIU·g-1,蛋白质偶联率52.4%,酶活性回收率50.8%。制备的抑肽酶比活力达5650KIU·mg-1,并且该吸附剂具有非特异性吸附小、能反复使用、机械强度高、活化简单、价格低廉等优点。     

160g/L氟虫脲+100g/L氟虫腈悬浮剂的高效液相色谱检测

采用高效液相色谱法测定农药复合制剂160 g/L氟虫脲+100 g/L氟虫腈悬浮剂。选用C_(18)反相色谱柱(150 mm×4.6 mm i.d,5μm),以乙腈+甲醇+水(体积比为42+36+22)为流动相,用紫外检测器在260 nm波长下,对试样中的氟虫脲和氟虫腈进行分离和定量检测。氟虫脲、氟虫腈的平均回收率分别为100.3%和99.5%,相对标准偏差分别为0.61%和0.25%。     

国外农药登记信息集锦

正陶氏益农的氟啶虫胺腈获爱尔兰登记近日,陶氏益农宣布其杀虫剂Isoclast~(TM)活性成分(ISO名:氟啶虫胺腈)获爱尔兰登记批准,爱尔兰成为第一个批准氟啶虫胺腈登记的欧盟成员国。陶氏益农的氟啶虫胺腈以商品名Closer~(TM)和Transform~(TM)在全球销售,已经过多个种植季的试验和科学研究验证。氟啶虫胺腈已获得欧盟登记批准,当依据产品标签使用,不会对人、有益动物和环境造成伤害。目前,氟啶虫胺腈已在全球40多个国家登记和使用。氟啶虫胺腈的获登为爱尔兰农民提供了一种新的防控蚜虫的工具。具有不同作用机理的农药对     

氟虫腈及其代谢物氟虫腈砜中主要有机杂质的定性及定量

建立了一种氟虫腈及其代谢物氟虫腈砜标准物质候选物中的主要有机杂质定性、定量分析方法。采用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法(HPLC-MS/MS)成功鉴别出氟虫腈中杂质分别为氟虫腈砜和氟虫腈硫化物,而氟虫腈砜中杂质为氟虫腈硫化物,推导出氟虫腈砜的结构式。HPLC-MS/MS外标法测定氟虫腈中杂质氟虫腈砜和氟虫腈硫化物的含量分别为0. 18%、0. 47%,相对标准偏差分别为0. 73%、0. 87%;氟虫腈砜中杂质氟虫腈硫化物的含量为0. 25%,相对标准偏差为8. 05%。该方法的研究对食品安全检验中氟虫腈及氟虫腈砜的准确测定具有重要意义。     

断裂内含肽介导的亲和介质与亲和标签的应用

应用Cfa断裂内含肽构建了一种新型的亲和纯化系统,并完成对目的蛋白无标签纯化。首先对Cfa断裂内含肽的IN片段与IC片段进行分子改造,通过研究在自由混合条件下的断裂情况,测定了其断裂速率。其次以改造后的IN片段作为配体与环氧活化的琼脂糖微球载体偶联,制备了IN亲和层析介质;IC片段作为亲和标签与目的蛋白GFP融合,并利用IN亲和层析介质实现对目的蛋白进行无标签纯化。结果表明,将IN与IC-GFP片段混合后,30s内即可断裂超过50%,4 h内即可完全断裂;IN亲和层析介质的静态载量为66.78 mg×m L~(-1),动态吸附载量约为30 mg×m L~(-1);纯化后的绿色荧光蛋白(GFP)纯度达到了96.7%,回收率为29.3%。Cfa断裂内含肽的应用为开发新型亲和纯化技术提供了一种潜在的方法。     

链球菌蛋白G免疫球蛋白结合域C3区串联体的表达、筛选与初步应用

筛选并制备高效结合抗体的重组蛋白G亲和层析介质。以链球菌蛋白G C3区为结构单元,拼接形成3、4、5、6个重复C3片段的串联体,分别克隆至PET21,并在E.coli BL21(DE3)中表达。经Ni~(2+)纯化的重组蛋白分别偶联至Purose 4 Fast Flow制备亲和层析介质,比较介质的吸附情况,发现重组四串体对h IgG的吸附量最高,其静态饱和吸附量为66.79 mg×mL~(-1),动态吸附载量为35 mg×mL~(-1)介质,优于同类型商品介质。利用该介质分离纯化小鼠腹水和人血清中的IgG,纯度在95%左右,回收率不低于80%。     

气相色谱-质谱法(GC-MS)测定蔬菜水果中氟虫腈及其代谢物残留

[目的]为了建立蔬菜水果中氟虫腈及其代谢产物氟甲腈(MB46513)、氟虫腈砜(MB46136)、氟虫腈硫醚(MB45950)残留测定的气相色谱-质谱(GC-MS)分析方法。[方法]样品采用乙腈提取、经NH2-SPE柱净化后,以气相色谱-质谱EI离子源,SIM模式检测。[结果]在0.010~5.0 mg/L范围内,供试的氟虫腈及其代谢物的质量浓度与其相应的峰面积间呈现良好的线性关系,相关系数(r2)均大于0.9993,在0.050、0.10、0.50 mg/kg 3个添加水平下,氟虫腈及其代谢物的平均回收率为91.8%~109.1%;相对标准偏差(RSD)为0.9%~8.5%。氟虫腈及其代谢物在蔬菜水果中的定量限(LOQ)为0.5~7.0μg/kg。[结论]该方法准确、灵敏、简单,适用于同时测定蔬菜水果中氟虫腈及其代谢物的残留量。     

QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法测定蜜蜂及蜂产品中5种农药及氟虫腈代谢物残留

[目的]建立蜜蜂及蜂蜜和蜂花粉中氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈砜、灭幼脲、氟啶脲、氟铃脲、杀铃脲等5种农药及氟虫腈代谢物的QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱分析方法(HPLC-MS/MS),并将该方法用于实际样品检测.[方法]样品中的农药残留用乙腈提取,盐析后用C18、PSA吸附剂净化,经C18色谱柱分离,在...     

腮腺炎病毒蛋白组分疫苗的免疫效果

目的观察腮腺炎病毒蛋白组分疫苗的免疫效果。方法SP株腮腺炎病毒液经灭活、浓缩、裂解后,采用SP SepharoseTM Fast Flow阳离子层析柱及Sepharose CL-4B分子筛层析柱纯化,收集各峰样品,经12%SDS-PAGE、Western blot分析及HPLC检测。并取第1峰样品免疫ICR及BALB/c小鼠,检测血清中和抗体效价及CTL杀伤活性。结果所收集的第1峰样品为单一的腮腺炎病毒蛋白组分。免疫ICR小鼠可诱导产生中和抗体,其免疫后各检测时间点的GMT水平与减毒活疫苗组相比,差异均无统计学意义;免疫BALB/c小鼠可诱导产生针对HN肽段的CTL杀伤活性,而减毒活疫苗组则未能诱导此特异性CTL反应。结论腮腺炎病毒蛋白组分疫苗在小鼠体内可诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答,为新型腮腺炎疫苗的研制提供了实验依据。     

pH effect on the separation of α-chymotrypsin by affinity chromatography

For the separation of enzyme (α-chymotripsin) the characteristics of affinity chromatography were studied. The system employed Sepharose CL-4B as a gel matrix (a packing meterial), 4-phenylbutylamine as a ligand and a-chymotrypsin as a solute. Moment analysis was used to determine the retention time in a column, in which the longitudinal dispersion in the mobile phase, the radial diffusion inside the porous spherical gel beads and the Sorption on the ligands attached to the gel bead were simultaneously taking place. To analyze the effect of pH on the retention time an ionization model was incorporated into the chromatrgraphic model. Dependence of adsorption equilibrium constant and the retention time on pH were investigated. From the experimental data the approximate pK values could be obtained.     

Purification and properties of an extracellular lipase fromPythium ultimum

An extracellular triacylglycerol lipase (EC 3.1.1.3) fromPythium ultimum strain No. 144 was purified by ammonium sulfate precipitation, and by diethylaminoethyl Sepharose CL-6B and Sephacryl S−200 chromatography. The purified enzyme preparation showed a prominent polypeptide band in polyacrylamide gel electrophoresis, associated with esterase activity according to activity staining. Molecular weight of the protein was estimated at 270 kD using gel filtration on Sephacryl S−200, and 68 kD by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis indicating that the enzyme may be a tetramer. The optimum pH and temperature for activity of the enzyme were 8.0 and 30°C, respectively. Activity was reduced by Co²⁺, Fe²⁺, Sn²⁺ and Mn²⁺ and stimulated by Ca²⁺, Mg²⁺, Na⁺, K⁺ and surfactants such as taurocholic acid, Triton X−100,n-octyl glucoside,n-dodecyl-β-D-maltoside, 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), and 3-[-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate. The apparent maximum specific activity was 42 μmole/min/mg in the absence of CHAPS and 77 μmole/min/mg in its presence. The reaction rate was progressively higher with increasing number of double bonds in the substrate, and the enzyme showed a preference for triacylglycerols containing fatty acids having thecis double bond configuration. AAES publication No. 6-933419.     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗纯化工艺的建立

目的建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)纯化工艺。方法采用Sepharose CL-6B凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析两步纯化法纯化脊髓灰质炎病毒,进行各项检定后再经除菌过滤和灭活。结果Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒纯化后的蛋白去除率均不低于98.81%,病毒滴度分别为8.75、8.50和8.63lgCCID50/ml,DNA残留量均<100pg/ml。除菌过滤和灭活后,D抗原含量略有下降。结论已建立了Sabin株IPV的纯化工艺,纯化后制备出了高纯度的Sabin株IPV。     

壳聚糖微珠亲和层析介质的制备及其初步应用

目的制备壳聚糖(CTS)微珠亲和层析介质,并进行初步应用。方法采用多种化学方法对CTS的表面基团进行改造,使其活化。用此改性CTS进行羊抗人IgG及小牛血清纤维连接蛋白(FN)的纯化。结果此改性的CTS微珠粒径在40￣160μm之间,每克可溶胀至4ml。活化的CTS对人丙种球蛋白的吸附量为15￣25mg/gCTS,对明胶的吸附量为5.8￣6.5mg/gCTS。采用此方法纯化的羊抗人IgG及FN与Sepharose4B法纯化效果一致。结论已制备的壳聚糖微珠亲和层析介质,其性质稳定且价格较低,是一种可以广泛应用的亲和层析介质。     

一种来源于康氏木霉的纤维素酶增效蛋白的分离纯化

引言在可持续发展、低碳经济的背景下,利用纤维素酶水解木质纤维原料生产燃料乙醇无疑是一项符合我国国情的能源战略[1]。然而纤维素酶的水解效率低是制约纤维素燃料乙醇生产的最大障碍。     

肝素-琼脂糖凝胶6FF的制备及其在抗凝血酶III分离纯化中的应用

以自制琼脂糖凝胶6FF为基质,肝素为配基,利用还原胺化方法制备了肝素-琼脂糖凝胶6FF介质. 考察了肝素偶联反应的影响因素,并对其进行了优化,得到肝素配基的含量为2.7 mg/mL. 用所制介质从人血浆中分离出抗凝血酶III,从血浆开始计算的抗凝血酶III活性回收率为31.76%,与商品Heparin-Sepharose CL-6B的分离效果相当.     

应用柱层析法纯化Vero细胞乙型脑炎疫苗

浓缩Vero细胞乙脑疫苗经SepharoseCL－6B柱层析可去除大部分杂蛋白，再经SphacrylS－500HR层析可进一步去除比病毒大的杂质及残余小分子量杂蛋白。经两步凝胶过滤层析纯化后，疫苗总蛋白含量减少约99％，抗原比活性提高87～165倍，抗原回收率达30％～50％，残余牛血清和残余细胞DNA均符合WHO有关规程要求，提纯疫苗的效力达到或超过中国地鼠肾灭活乙脑疫苗和日本提纯鼠脑拔苗的参考苗。     

HIV-1型衣壳蛋白P24在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

用聚合酶链式反应 (PCR)从 HIV - 1gag基因序列中扩增出衣壳蛋白 (P2 4)基因 ,插入表达载体p GEX- 4T3中 ,构成重组质粒 p GEX- p2 4,在大肠杆菌 BL 2 1中高效表达出重组 P2 4。经 Glutathione- Sepharose4B亲和层析纯化后 ,重组 P2 4在间接 EL ISA和免疫印迹中表现出很高的抗原特异性和免疫反应性。     

Vero细胞疫苗生产过程中宿主细胞蛋白含量分析

目的了解Vero细胞疫苗中间产品中宿主细胞蛋白(Host cell protein,HCP)的含量变化。方法模拟Vero细胞疫苗生产工艺流程,制备Vero细胞HCP,免疫家兔制备Vero细胞HCP免疫血清,经Protein ASepharose CL-4B亲和层析,制备纯化的抗Vero细胞HCPIgG,通过SDS-PAGE和Western blot分析Vero细胞乙型脑炎疫苗及Vero细胞SARS疫苗各中间产品的蛋白、HCP及病毒抗原成分的含量变化。结果Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗中间产品中均存在一定量HCP,不同的纯化工艺均可以去除大部分HCP,随着生产工艺的进行,疫苗中间产品中HCP的含量逐渐降低,病毒成分的纯度逐渐增高,但纯化后产品中仍存在少量HCP。结论Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗均存在一定量HCP。