海产品中溶藻弧菌的分离及多种方法鉴定效果的比较

目的了解北京市市售海产品中溶藻弧菌的污染情况,并对使用不同方法鉴定溶藻弧菌的效果进行比较。方法样品经碱性蛋白胨水增菌后,分别于硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖(TCBS)琼脂培养基和科玛嘉弧菌显色培养基上划线培养,实时荧光聚合酶链式反应(PCR)法鉴定可疑菌落。以rpoB基因测序方法为参考,比较了实时荧光PCR和VITEK两种方法的鉴定效果。结果对北京市水产品市场随机采集的116份海产品进行了检测,实时荧光PCR法鉴定出溶藻弧菌阳性样品95份,检出率高达82%。使用科玛嘉弧菌显色培养基的检出率高于TCBS培养基,分别为82%(95/116)和72%(83/116)。经rpoB基因核苷酸序列测定确定95株疑似菌株为溶藻弧菌。采用VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡对这95株菌株进行鉴定,31株鉴定为溶藻弧菌,其余未能得到准确的鉴定结果。结论北京市市售海产品中溶藻弧菌检出率高。科玛嘉弧菌显色培养基比TCBS琼脂培养基更适于溶藻弧菌的分离,实时荧光PCR法的鉴定效果优于VITEK法。     

水产品中创伤弧菌检测方法建立与应用

目的建立一种水产品中创伤弧菌检测方法 ,并对北京市市售水产品中创伤弧菌污染情况进行监测。方法分别使用18株创伤弧菌菌株和水产品中常污染的背景杂菌,定量接种于检测创伤弧菌的选择性增菌液和4种选择性平板,优化出适合创伤弧菌检测的选择性培养基。采用聚合酶链式反应(PCR)法和增菌培养法分别检测样品中的创伤弧菌后进行方法对比,建立PCR和增菌培养法相结合的检测方法 ,并应用此方法研究北京市市售水产品中创伤弧菌污染状况。结果改良后的选择性增菌液适用于创伤弧菌的检测。北京市市售水产品中创伤弧菌检出率为15.7%(18/115),其中贝类、蟹类、鱼类和虾类样品的检出率分别为23.4%(15/64)、8.3%(1/12)、5.3%(1/19)和5.0%(1/20)。结论 PCR法与传统增菌培养法相结合,可有效提高创伤弧菌检测效率。北京市市售贝类等水产品中创伤弧菌污染率较高,需引起食品安全风险监测重点关注。     

上海市售海产品中副溶血性弧菌的分布状况

海产品中副溶血性弧菌引起的食物中毒已成为我国沿海地区细菌性食物中毒的首要病原。本研究中针对上海市闵行区某农贸市场的海产品开展为期1年的调查分析,共采集257份样品。按照国家标准(GB/T4789.7-2008),以硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基(TCBS)和科玛嘉弧菌显色培养基(CV)两种选择性培养基辅助分离副溶血性弧菌疑似菌株,结合生化试验和PCR方法对疑似菌株进行鉴定,从84份阳性样本中获得107株副溶血性弧菌分离株。其结果表明:该农贸市场市售海产品中副溶血性弧菌的污染率为32.7%,其中牡蛎中副溶血性弧菌污染率最高(达54.4%),蛤蜊和海瓜子次之(分别为33.9%,25.6%)。牡蛎中副溶血性弧菌的污染水平与季节性变化直接相关。对107株分离株的主要毒力基因tdh和trh进行PCR筛查,tdh阳性菌株为10株,trh阳性菌株为1株,并且此株菌为tdh、trh双阳性菌株,tdh和trh的携带率分别为9.4%和1.0%,tdh、trh双基因的携带率为1.0%。结论:市售海产品中副溶血性弧菌污染状况较为严重。这为政府相关职能部门开展食品安全防控提供了参考依据。     

纳米免疫磁分离-实时荧光聚合酶链式反应快速检测海产品中副溶血性弧菌

采用副溶血性弧菌单克隆抗体、纳米免疫磁分离技术,结合实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,建立海产品中副溶血性弧菌纳米免疫磁分离-实时荧光PCR检测方法。副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为103 CFU/mL水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。在纯培养、无需增菌情况下,该方法检测灵敏度达到140 CFU/mL;通过134 株副溶血性弧菌和74 株非目标菌的测试,实时荧光PCR技术具有良好的特异性;在食品基质添加实验中,其检测限为2 CFU/25 g样品,增菌时间缩短到8 h。     

海产品中副溶血性弧菌免疫磁分离和环介导等温扩增快速检测方法的建立

采用纳米免疫磁珠分离副溶血性弧菌,建立副溶血性弧菌环介导等温扩增检测方法。方法 采用副溶血性弧菌单克隆抗体,制备纳米免疫磁珠,特异性吸附副溶血性弧菌,结合环介导等温扩增技术,建立副溶血性弧菌快速检测方法。结果 副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为10³cfu/ml水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。免疫磁分离结合环介导等温扩增技术,在纯培养、无需增菌情况下,检测灵敏度达到140cfu/ml增菌液;通过对134株副溶血性弧菌和74株非目标菌的测试,环介导等温扩增技术具有良好的特异性;食品基质添加试验中,在增菌时间缩短至8h的条件下,其检测限为2cfu/25g样品。结论 副溶血性弧菌免疫纳米磁珠结合环介导等温扩增技术,有效缩短了增菌时间,适用于副溶血性弧菌的快速检测。     

不同来源的副溶血性弧菌生物学特性研究

为掌握浙江省不同来源的副溶血性弧菌的血清型分布及毒力基因携带情况，采用血清凝集试验对333株副溶血性弧菌进行血清型分型，采用PCR技术检测副溶血性弧菌的毒力基因TDH。临床副溶血性弧菌菌株血清型分布于7个O抗原群，以O3为主，占临床菌株数的71.81％；04血清型与往年相比有所上升，占到了16．60％。海产品菌株的血清型分布于8个O抗原群，以O5为主，占所有海产品菌株的47．30％。临床菌株的TDH检出率为95．65％。海产品菌株的TDH检出率为6．06％。血清型相同但来源不同的菌株的TDH检出率不同。浙江省从海产品中分离出的副溶血性弧菌菌株与分离自食源性疾病患者的副溶血性弧菌菌株的主要血清型、毒力基因TDH都存在差别。该工作为预防副溶血性弧菌引起的食品中毒提供了科学依据。     

海产品中副溶血弧菌的分离和PCR检测

为了建立一种快速、特异的PCR方法检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp),根据Genebank库中收录的Vp的tlh基因序列进行引物设计,应用PCR技术扩增tlh基因。利用TCBS和TSI2种选择性培养基从海产品总分离出68株疑似副溶血弧菌,经生化鉴定68株均为副溶血弧菌。用Chelex100法提取基因组DNA,进行tlh基因的PCR检测,tlh基因在不同副溶血弧菌中都广泛存在,而大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等其他食源性致病菌均为阴性。tlh基因具有种属特异性,因此可以用来检测副溶血弧菌。     

北京一起副溶血性弧菌和非O1/O139霍乱弧菌共感染导致急性胃肠炎暴发事件病原检测分析

目的 对一起副溶血性弧菌和非O1/O139霍乱弧菌共感染导致急性胃肠炎暴发事件进行实验室病原学分析。方法 采用实时荧光PCR方法对4个病例肛拭子、12件可疑污染食品和8件环境涂抹的增菌液进行多种腹泻病原检测,将副溶血性弧菌和霍乱弧菌分离培养,并对分离株进行全基因组测序,获取菌株毒力基因和耐药基因,基于核心基因组单核苷酸多态性构建聚类树。结果 4件病例肛拭子增菌液荧光PCR检测副溶血性弧菌结果均为toxRVP+/tdh+/trh-,其中2件肛拭子荧光PCR检测霍乱弧菌结果为阳性。病例肛拭子副溶血性弧菌培养法检出率为100%(4/4),分离株均为toxRVP+/tdh+/trh-,血清型均为O4:KUT;病例肛拭子霍乱弧菌培养法检出率为50%(2/4),均为非O1/O139血清型,其中1分离株为toxR_VC+/ctx-/t3ss+。可疑污染食品副溶血性弧菌培养法检出率为66.67%(8/12),环境涂抹副溶血性弧菌检出率为12.50%(1/8),可疑污染食品和环境副溶血性弧菌分离株均为toxRVP+/tdh-/trh-;可疑污染食品霍乱弧菌检出率为25.00%(3/1...     

冷冻水产品中副溶血性弧菌的实时荧光PCR检测方法研究

文章研发了一种可在16 h内完成冷冻水产品中副溶血性弧菌快速检测的方法。方法在首先完成样品的预增菌工作后，采用高温热裂解法与核酸亲和膜吸附法提取冷冻水产品等样品中的检材总DNA，设计副溶血性弧菌专一引物探针，运用实时荧光定量PCR技术扩增试样中副溶血性弧菌基因组保守基因片段，同时开展与国家标准方法的比对工作证实方法的可靠性，建立了特异性好、高检测通量的PCR检测方法。为验证所建立方法的适用性与稳定性，本研究从市场中随机抽取共331份冷冻水产品样品开展副溶血性弧菌的筛查检测，结果表明采用该方法在上述抽样调查的冷冻水产品中3份样品的副溶血性弧菌特异性的基因片段被扩增检验出，试样的目标菌检出率约为0.9%(3/331)，该研究PCR方法的DNA检出限可达到0.01 ng/μL。     

两种弧菌显色培养基在疑似副溶血性弧菌鉴定中的效果比较

为了比较环凯和科玛嘉弧菌显色培养基对食品中可疑菌株的初步鉴定作用,本文按国标(GB/T4789.7-2008)程序,以环凯和科玛嘉弧菌显色培养基初步鉴定硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂(TCBS)的副溶血性弧菌可疑菌株,最后用API和MID鉴定证实。在97份食品样品的定性与定量检测中,TCBS疑似菌株有109株,对应样品有31份。环凯和科玛嘉弧菌显色培养基对109株TCBS可疑菌株初步鉴定的结果相同,均检出64株显紫色的可疑菌株,对应样品22份。经API和MID确认,阳性菌株60株,阳性样品为22份,阳性率为22.68%。两种培养基初步鉴定TCBS可疑菌株的敏感性、特异性和符合性均分别为100.00%、91.84%和96.33%。环凯和科玛嘉弧菌显色培养基对TCBS的可疑菌株具有较好的初步鉴定效果。     

提升副溶血性弧菌检验前增菌速度

为有效缩短前增菌时间并打破副溶血性弧菌快检的技术瓶颈,研究通过优化培养基配方和培养条件,探索提升副溶血性弧菌前增菌速度的技术方法。通过单因素和响应面分析确定最适培养基配方为：大豆蛋白胨7.4 g/L、酵母浸粉9.8 g/L、牛心浸粉20.6 g/L,Na Cl 30.0 g/L,p H8.0。最佳培养条件为：温度36℃,转速180 r/min。应用优化的增菌培养方法,对副溶血性弧菌增菌培养6h后,即可获得满足荧光聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)检测灵敏度要求的增菌液。在添加食品基质的样本中,与GB 4789.7增菌方法相比,优化的增菌培养方法表现出了较高的增菌效率。研究结果表明,改良培养基配方和改善培养条件均可以有效缩短副溶血性弧菌检测的前增菌时间。大幅缩短增菌时间可以为实现食源性致病菌快检奠定基础。     

食品中副溶血性弧菌PCR快速检测方法的研究

为建立食品中副溶血性弧菌 (VP)的PCR检测方法 ,选取tl基因作为靶序列设计一对引物 ,用该引物对 14株从国内食品中分离的副溶血性弧菌 (经传统方法验证 )和 30株非副溶血性弧菌进行PCR扩增 ,并用此方法对人工污染食品进行检测。扩增片段表现出极好的特异性 ,对人工污染的冷冻虾仁、沙丁鱼的检出限为 10CFU g ,且与传统方法结果吻合。该方法适宜于食品中副溶血性弧菌的检测。     

北京口岸进口鲜活海产品中副溶血性弧菌致病性分析

目的调查从北京口岸进口的鲜活海产品中是否存在致病性副溶血性弧菌。方法对2005年从北京口岸进口的鲜活海产品中分离的267株副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的尿素酶活性、神奈川现象和毒性基因（tdh和trh）进行了检测。结果267株副溶血性弧菌中27株尿素酶呈阳性，其中14株菌tdh基因和砌基因呈阳性。tdh基因和trh基因呈阳性的14株菌中有10株菌神奈川现象为阳性，并且全部分离自从加拿大进口的象拔蚌。结论北京口岸进口的鲜活海产品中存在致病性副溶血性弧菌，主要集中在象拔蚌中。应对从加拿大进口的象拔蚌加强监管，防止致病性副溶血性弧菌引起食物中毒发生。     

北部湾茅尾海副溶血性弧菌的分离鉴定与致病性分析

为解析北部湾海域及水产品中副溶血性弧菌的多样性特征与安全风险,本研究采集了北部湾茅尾海养殖区域海水和水产经济动物样品,利用硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)对所采样品进行海洋弧菌的分离和纯化,共分离获得109株疑似弧菌菌株。通过16S rDNA和特异功能基因toxR的PCR扩增并测序鉴定,共检出副溶血性弧菌20株,检出率为18.3%。此外,通过系统发育分析还发现副溶血性弧菌的toxR和tdh基因序列都存在水平基因转移现象,呈现出较大的多样性。对20个副溶血性弧菌菌株的毒力基因tdh进行分析,结果表明有4株携带了tdh毒力基因,检出率为20%,易引起食物中毒,对公共卫生造成的威胁较大。因此,本研究建议采用PCR技术开展副溶血性弧菌特异种属基因和毒力基因检测,准确评估北部湾区域海水及其水产品的卫生安全性,降低爆发水产养殖业病害和食源性疾病的风险。     

首次从进口鳕鱼中分离出副溶血性弧菌

本文报告1988年从苏联进口鳕鱼中首次检出副浴血性弧菌两株,作者按着卫生部制定的海产品微生物学与副溶血性弧菌检验规程,采集进口鳕鱼样本,经进行增菌培养、分离培养、生化鉴定、0/129抑制试验、G Com1%测定及动物试验后,鉴定为副溶血性弧菌。     

东南沿海地区零售海产品中创伤弧菌的监测

目的了解我国东南沿海地区零售海产品中创伤弧菌的污染状况。方法采用3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌,改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E(mCPC)琼脂和纤维二糖-多粘菌素E(CC)琼脂分离海产品试样中的创伤弧菌,可疑菌落的鉴定采用生化试验或PCR法。采用最可能数(MPN)法和PCR法检测牡蛎试样的创伤弧菌污染水平。结果天然污染海产品试样创伤弧菌的检出率为19.8%(20/101)。牡蛎试样中45%(55/122)创伤弧菌密度低于3MPN/g的最低检出限。牡蛎中创伤弧菌的污染水平存在季节性差异。结论未来应加强对我国海产品中创伤弧菌污染状况的监测,尤其是在温暖的季节。     

漳州市夏秋季主要贝类中副溶血性弧菌分布情况分析

调查漳州市售主要贝类中副溶血性弧菌的带菌状况,为消费者提供食品安全风险参考。从漳州市区的8大市场无菌采集花蛤、文蛤和蛏的新鲜样品;用硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS)分离纯化疑似菌落,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增不耐热溶血素基因(thermolabile hemolysin,tlh)的特异片段;并对分子检测阳性的菌株进行生化鉴定。结果表明,采集到53份花蛤、50份文蛤和42份蛏的样品,经过TCBS筛选分别得到37株、45株和36株疑似菌落,分离率分别为69.8%、90.0%和85.7%;PCR确定副溶血性弧菌阳性率分别为35.8%(19/53)、30.0%(15/50)和54.8%(23/42);革兰氏染色和主要生化实验确定疑似菌均为副溶血性弧菌,符合率达100%。漳州市所售水产品受副溶血性弧菌污染较为严重,市民食用需严格无害化处理,避免不同种类水产品间的交叉污染。      

海口市市售贝类海产品副溶血性弧菌污染调查及耐药和毒力基因研究

目的了解海口市市售贝类海产品中副溶血性弧菌的污染情况、菌株血清学分型情况以及不同来源菌株的耐药情况,分析海口市市售贝类海产品受副溶血性弧菌污染的特点。方法 2014—2016年,按照GB 4789.7—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》和《国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》对五类海产品(白贝、排海、毛蚶、蛏子、芒果螺)进行副溶血性弧菌分离鉴定和血清学分型,采用实时荧光聚合酶链式反应(PCR)进行毒力基因检测,采用K-B法对分离菌株进行相关耐药分析。结果五类海产品样品共157份,其中65份样品检出副溶血性弧菌,白贝的检出率最高,为63.6%(21/33)。所分离的65株副溶血性弧菌主要血清群为O3和O5,完全分型26株,总体分型率为40.0%,其中以O1∶K25为主要血清型。65株菌对氨苄西林普遍耐药(95.4%,62/65),对头孢噻肟的中介率较高(33.8%,22/65),对8种抗生素产生了5种耐药谱。65株分离菌株神奈川试验结果均为阴性,且均未检出与致病性相关的耐热直接溶血素(TDH)及耐热相关溶血素(TRH)。结论海口市市售贝类副溶血性弧菌污染较重,应加强养殖区域海水水质的监测力度,预防副溶血性弧菌感染。     

多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌

目的建立检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血性弧菌tlh基因,沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和Taq Man探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌。结果副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌可得到特异性扩增,而共存于海产品中的其他细菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系对副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的最低检测限分别为72、40、80 cfu/ml。对舟山采集的150份样品进行检测,检出32份副溶血性弧菌、11份沙门菌、5份单增李斯特菌,与国标法检测结果一致。结论本研究建立的基于Taq Man探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简单快速地实现对海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的检测。     

水产品中副溶血性弧菌特异性二重PCR检测方法的研究

建立快速检测水产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahae-molyticus)的二重PCR方法.以副溶血性弧菌特异性基因tlh和toxR为靶基因,选择2对引物,对5株副溶血性孤菌和40株非副溶血性弧菌进行特异性检测;梯度稀释副溶血性弧菌基因组DNA,以不同稀释度DNA作PCR扩增;在鱼肉样品中以不同菌量人工污染,不同增菌时间培养,提取DNA进行PCR扩增;应用该方法对实际样品进行检测.以tlh和toxR为靶基因的两对引物对副溶血性弧菌的检出有很好的特异性.PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到28.76 pg;人工污染样品,当起始污染量为1 CFU/mL时,37℃增菌培养10 h即可检出.本试验一共检测了21份水产品样品,有14份检出了副溶血性弧菌.