赭曲霉毒素A直接竞争ELISA试剂盒的研制

在多克隆抗体的基础上研制了赭曲霉毒素A(OTA)直接竞争酶联免疫检测(cd-ELISA)试剂盒.在0 ～ 10 ng/mL范围内,该试剂盒50％抑制率(IC50)为1.09 ng/mL,检测灵敏度(IC15)为0.08 ng/mL;与赭曲霉毒素B、C的交叉反应率分别为6.28％和0.16％,而与黄曲霉毒素B1等生物毒素未见有交叉反应;板内与板间平均变异系数分别为2.21％和2.79％;花生、玉米和玉米粉3种样品中OTA的检测低限分别为1.71,1.26和1.85 μg/kg,平均添加回收率在83.80％～ 91.40％;与HPLC检测方法具有较高的相关性,相关系数(R2)分别为0.94、0.88和0.90;检测时间只需20 min,可用于花生、玉米及玉米粉中OTA的批量快速筛查.     

赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫亲和柱的制备

制备了赭曲霉毒素A(OTA)单克隆抗体免疫亲和柱,并用间接竞争ELISA和HPLC法评价了免疫亲和柱的性能,其柱容量(结合OTA的能力)约为200ng,加标回收率为90.38%～100.1%,可反复使用3次。 建立了免疫亲和柱-HPLC联用分析谷物中OTA的方法,最低检出限为0.2μg/kg,线性范围为0.6～400μg/kg,OTA加标量为1～10μg/kg时谷物样品中的回收率为78.7%～87.1%,变异系数小于6.5%。用此法检测了大米、小麦、玉米和玉米饲料等15份市售样品,检出率为46.7%,其中OTA的最高含量为0.785μg/kg。     

化学发光免疫分析方法检测粮食谷物中赭曲霉毒素A残留

目的建立粮食谷物中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)残留检测的化学发光免疫分析方法。方法人工改造OTA半抗原、制备包被原和多克隆抗体工作液,优化检测步骤,验证各项评价指标,比较化学发光免疫分析方法和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)的实际样本检测结果的一致性,以此来实现化学发光免疫分析方法的建立。结果 50%抑制浓度(IC_(50))为0.278μg/L;OTA的最低检出限为5.0μg/kg,样本添加回收率在65.4%到115.8%之间,批内、批间相对标准偏差15%。同时,通过对实际样本检测,证明化学发光免疫分析方法具有显著的准确度和可靠性。结论基于化学发光免疫分析方法能够实现粮食作物中的OTA残留的快速检测,灵敏度高、成本低、时间短,为食品中霉菌毒素残留的快速检测提供了新的技术参考。     

抗赭曲霉毒素A五价纳米抗体的表达及分析

利用霍乱毒素B亚基(B subunit of Cholera toxin,CTB)能自组装形成五元环状结构,将霍乱毒素B亚基与纳米抗体(VHH28)进行融合从而达到纳米抗体多聚化的目的。将重组载体pET25b(+)-CTB-VHH28转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,对诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,SDS-PAGE凝胶电泳分析融合蛋白表达情况。结果显示CTB-VHH28为可溶表达,其中单体分子量大小约30 kDa,五聚体分子量大小约150 kDa,均与预测的分子量大小一致;确定了其最优表达条件为:IPTG浓度为0.05 mmol/L,诱导温度为16℃,诱导时间为10 h。经过镍柱纯化后成功得到了纯度较高的五价纳米抗体,表达量为20 mg/L。对其活性进行测定,结果表明CTB-VHH28能与赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)特异性结合,在2.5%甲醇条件下,间接竞争ELISA半抑制浓度(IC₅₀)为0.38 ng/mL。热稳定性及甲醇耐受性结果显示,CTB-VHH28在25~55℃具有良好的热稳定性,反应体系中甲醇浓度低于20%时,竞争抑制率变化不大,具有较好的甲醇耐受性。结论:本研究所制备的五价纳米抗体可以用于OTA检测。     

赭曲霉毒素A单克隆抗体的体外制备及其重组抗体的构建研究

目的 实现抗赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)单克隆抗体的体外制备及其重组抗体表达载体的构建与瞬时转染表达。方法 以前期获得的OTA杂交瘤细胞株(O16)为研究对象,通过无血清驯化培养的方式开展OTA单克隆抗体的体外制备研究;采用简并引物法获取OTA杂交瘤细胞的单克隆抗体编码基因,在此基础上构建OTA重组全长抗体表达载体以及OTA重、轻链可变区基因片段与人源恒定区片段连接的重组嵌合抗体表达载体,并基于哺乳动物细胞系,开展两种重组抗体的瞬时转染表达研究。结果 通过缓降血清浓度的方式对OTA杂交瘤细胞进行无血清驯化,实现了体外培养制备OTA单克隆抗体;在此基础上测得OTA单克隆抗体的重链和轻链基因序列,并成功构建了OTA重组全长抗体表达载体(pCDNA3.4-OTA-H/L)和重组嵌合抗体表达载体(p FUSE-OTA-H/L),通过共转染实现了两者在哺乳动物细胞系中的瞬时转染表达;经间接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)确定体外培养制备的OTA抗体、OTA重组全长抗体和嵌合抗体均具备特异性结合抗原的能力,三者的...     

酶联免疫吸附法快速检测饲料中赭曲霉毒素A

目的建立一种酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)快速检测饲料中赭曲霉毒素A快速的方法。方法样品采用60%的甲醇溶液提取,提取液经过离心、快速滤纸过滤后,用稀释缓冲溶液按10倍的比例对提取液进行稀释即为试样液,采用酶联免疫吸附方法进行检测。结果在加标浓度为25、50和100μg/kg的加标水平下,赭曲霉毒素A在饲料中的加标回收率为88.4%~134.6%,变异系数为3.5%~6.9%。抽取10份样品进行检测,赫曲霉毒素A含量在14.1~38.2μg/kg。符合国家的标准GB 13078-2017对饲料中赫曲霉毒素A含量的规定。结论本方法灵敏度高、快速简便,适用于饲料中赭曲霉毒素A的快速批量检测。     

抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及免疫学鉴定

通过碳化二亚胺法(EDC法)制备免疫原OTA-BSA,并免疫小鼠,经杂交瘤技术建立产抗赭曲霉毒素A(OTA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株1株。通过体内诱生腹水法制备腹水,纯化后对其亚型、效价、灵敏性、亲和性、特异性等免疫学特性进行鉴定;单抗亚类为IgG1型,间接ELISA效价1:6.4×105,IC50为112.8pg/mL,亲和常数为9.74×1011L/mol,与赭曲霉毒素B交叉反应率为5.6%,与其他常见真菌产物交叉小于0.003%;本实验制备的抗OTA单克隆抗体具有高效、敏感、特异等特点,适合OTA的免疫学快速检测。     

谷物中赭曲霉毒素A化学发光酶免疫分析法的建立

建立了间接竞争化学发光酶免疫法检测赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA),该方法IC50为112 pg/mL,检出限是2.47 pg/mL,平均批内和批间变异系数分别为7.03%和14.7%。在大米和小麦样本中添加浓度1.5～6μg/kg的OTA标品,平均回收率在66.97%～97.96%之间,与其他常见真菌毒素未见交叉反应。将该方法应用于30份谷物样本(包括20份大米样本和10份小麦样本)中OTA的检测,检测结果与商品化ELISA试剂盒的相关系数R2=0.942 4。该方法简单、灵敏、快速、准确适用于谷物中OTA的检测。     

赭曲霉毒素A的研究进展

赭曲霉毒素A主要由赭曲霉和青霉属的某些菌株产生,广泛分布于谷物、其他植物性食品及相关产品和动物性食品,对动物和人体具有肾脏毒性、肝脏毒性,另外还有致畸、致突变和致癌作用,并有免疫抑制作用.随着对其研究的不断深入,现在愈来愈受到人们的关注,本文就赭曲霉毒素A对食品的污染、毒性、检测方法等方面进行综述.     

赭曲霉毒素A快速检测技术研究进展

赭曲霉毒素A危害大且污染范围广,快速、灵敏的赭曲霉毒素A的检测方法可以有效监控其污染。本文综述了赭曲霉毒素A的快速检测技术研究进展,集中在酶联免疫技术、胶体金免疫层析技术、免疫亲和柱层析净化-荧光光度法联用技术以及其较新的非免疫技术等,并对其中存在的问题和发展方向进行了讨论与展望。     

以赭曲霉毒素A单克隆抗体建立竞争酶联免疫吸附分析方法的研究

本研究通过活性酯法合成赭曲霉毒素A人工抗原，免疫小鼠制备单克隆抗体，在此基础上建立了竞争ELISA检测方法，线性范围为200-6000pg／ml，检测下限为150pg／ml。单抗与赭曲霉毒素B的交叉反应率为35％，与桔霉素、黄曲霉毒素B1和展青霉素等毒素交叉反应低于0．01％。在小麦样品中的加标回收率为83％～116％，变异系数为9.4％-19．8％。测试23份样品，赭曲霉毒素A的含量在0．6～2．56μg／kg之间。     

隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备及鉴定

研究制备孔雀石绿(MG)代谢物隐性孔雀石绿(LMG)多克隆抗体进而间接鉴定鱼体中孔雀石绿的残留。首先利用化学方法合成含羧基的隐性孔雀石绿衍生物(CLMG),然后采用碳化二亚胺法偶联牛血清白蛋白(BSA)合成免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA,按照常规免疫程序免疫新西兰大白兔制备抗隐性孔雀石绿多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附实验(iELISA)测定抗血清中抗隐性孔雀石绿多克隆抗体效价。结果表明：抗隐性孔雀石绿的抗体效价为1: 32000,可用于隐性孔雀石绿的免疫学检测。     

重金属铅多克隆抗体的制备及鉴定

目的：合成铅离子完全抗原,并对其进行鉴定;用合成的完全抗原免疫Balb/c 小鼠制备多克隆抗体,鉴定效价和特异性。方法：用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA 将Pb2+ 与载体蛋白BSA 和OVA 偶联在一起,合成免疫抗原(Pb-DTPA-BSA)和检测抗原(Pb-DTPA-OVA),并通过SDS-PAGE、紫外扫描、电感耦合等离子体(ICP) 检测抗原中Pb2+ 含量,以及通过免疫Balb/c 小鼠,采集血清进行间接ELISA 和竞争ELISA 检测。结果：两种合成的抗原相对于各自的载体蛋白均出现了蛋白条带滞后,紫外吸收峰偏移等现象;免疫的4 号和5 号Balb/c 小鼠的抗血清效价达1:400000;与OVA 无交叉反应,ELISA 检测IC50 值为1.5ng/mL,与Fe3+ 有近5% 的交叉反应,与其他重金属离子的交叉反应均小于1%。结论：铅离子多克隆抗体制备成功。     

灵芝酸A多克隆抗体制备及酶联免疫吸附测定法的建立

以牛血清白蛋白为载体,采用活化酯法合成灵芝酸A的偶联抗原作为免疫原,按照免疫程序接种试验兔,获得针对偶联抗原的多克隆抗体。对多克隆抗体的效价及靶向进行分析后,构建灵芝酸A的间接竞争酶联免疫吸附测定法。结果显示：多克隆抗体中存在靶向偶联抗原3个区域的独特型抗体,总效价为1∶78 125,其中抗灵芝酸A特异性抗体效价为1∶3 125。间接竞争酶联免疫吸附测定法的灵芝酸A检出限为0.3μg/L,半数抑制浓度为4.0μg/L,线性范围在0.6～27.3μg/L之间。样品测定批间变异系数低于10%,样品加标回收率在82.9%～118.6%之间,对22份灵芝粉剂产品的测定结果显示不同品牌产品中灵芝酸A含量的差异极显著,该法测定结果与高效液相色谱法的测定结果相比,相关系数为0.972。结果表明,间接竞争酶联免疫吸附法测定灵芝酸A可行,该方法能够为灵芝保健品市场中相关产品的质量监控提供一种辅助方案。     

链霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

通过研究链霉素(SM)人工抗原的合成和多克隆抗体的制备,建立链霉素残留的免疫分析方法。以氧-缩甲基羟胺肟化链霉素的醛基,引入羧基,再用碳二亚胺法将半抗原与蛋白质载体连接,合成免疫原SM-cBSA。用戊二醛法合成包被原SM-OVA。用紫外扫描、SDS-PAGE分析偶联情况,计算得链霉素与cBSA、OVA的分子偶联比分别为7.6:1与17.7:1。经动物免疫获得效价为1:40000的链霉素多克隆抗体,采用间接竞争ELISA测定IC50为3.32ng/mL,与双氢链霉素的交叉反应率为105.21%,与同类的其他药物均无交叉反应。     

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

本研究采用肟化法用羧甲基羟胺半盐酸盐对链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸(Tenuaconic acid,TA)进行衍生后引入连接臂,得到了半抗原TAO。通过活性酯法将半抗原TAO分别与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联制备得到免疫原TAO-BSA、与血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联制备得到包被原TAO-KLH。经透析纯化后分别采用紫外光谱、红外光谱扫描法对合成的人工抗原进行初步鉴定,制备得到的人工抗原的偶联比分别为18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后获得的鼠源抗血清进一步验证了人工抗原合成成功,制备得到特异性识别TA的多克隆抗体。通过ELISA棋盘法确定了最佳包被原浓度以及最佳抗体稀释度并建立了TA间接竞争ELISA检测方法,其灵敏度以半抑制浓度IC50表示为335.55 ng/m L,最低检出限(LOD)为19.00 ng/m L,定量线性检测范围为200.00~1563.00 ng/m L。     

副溶血弧菌多克隆抗体的制备及其特性分析

确定了副溶血弧菌多克隆抗体的制备方法:用体积分数0.05%甲醛于30℃灭活副溶血弧菌4 h制备抗原,并将此抗原分多次,以不同剂量免疫新西兰大白兔获得特异性多克隆抗体,以山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,通过间接ELISA法测定其多克隆抗体的效价、敏感性和特异性。结果表明:在免疫的第5周产生大量高效价抗体,效价最高可达1.6×105;此多克隆抗体对副溶血弧菌检测灵敏度为1×105CFU/mL;交叉反应和阻断试验结果显示,此多克隆抗体具有很强的特异性。     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。