人参皂甙—α—鼠李糖苷酶分离提纯及其酶性质

主要研究微生物sp．G9产皂甙鼠李糖苷酶的分离提纯及其酶性质。该酶能够水解人参皂甙Re的C-6位末端上的一个α-鼠李糖基，从而制备人参皂甙Rg1。该酶蛋白的分子量约为54kDa，且酶反应的最佳温度是40℃，最适pH值是5。     

芦丁-α-鼠李糖苷酶分离提纯及其酶性质

报道了微生物sp.R9g产芦丁 α 鼠李糖苷酶的分离提纯及其酶性质鉴定。该酶能水解芦丁的一个 α 鼠李糖基,从而制备异槲皮甙。该酶蛋白的分子量约为72kDa,且酶反应的最佳温度是40℃,最适pH值是5。     

芦丁-α-鼠李糖苷酶分离提纯及其酶性质

报道了微生物sp．R9g产芦丁-α-鼠李糖苷酶的分离提纯及其酶性质鉴定。该酶能水解芦丁的一个-α-鼠李糖基，从而制备异槲皮甙。该酶蛋白的分子量约为72kDa，且酶反应的最佳温度是40℃，最适pH值是5。     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的亚克隆及表达

将人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因。结果显示,重组酵母菌在甲醇体积分数为0.5%,72 h培养后,所提取的酶蛋白经酶活性检测,发现具有人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其分子质量为52 ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的cDNA5’末端的快速扩增

根据人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的CDS区已知序列设计引物，应用“去帽法”原理快速扩增出了人参皂苷-α-鼠李糖苷酶cDNA5’端未知序列．测序结果表明，扩增出的5’端未知序列长度为421bp．通过与已知的CDS区序列比对，确定扩增出的5＇端未知序列就是目的序列，其5’端非编码区长度为61bp．     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的亚克隆及表达

将人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因。结果显示,重组酵母菌在甲醇体积分数为0.5%,72 h培养后,所提取的酶蛋白经酶活性检测,发现具有人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其分子质量为52 ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的cDNA 5′末端的快速扩增

根据人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的CDS区已知序列设计引物,应用"去帽法"原理快速扩增出了人参皂苷-α-鼠李糖苷酶cDNA 5′端未知序列.测序结果表明,扩增出的5′端未知序列长度为421 bp.通过与已知的CDS区序列比对,确定扩增出的5′端未知序列就是目的序列,其5′端非编码区长度为61 bp.     

芦丁-α-鼠李糖苷酶基因的克隆

根据芦丁-α一鼠李糖苷酶N端氨基酸序列设计简并引物，从Absidia sp．R9g的总RNA出发，通过逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)扩增出芦丁-α-鼠李糖苷酶基因片段。将RT-PCR获得的1条1．6kb的目的条带与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞。酶切鉴定结果表明目的片段克隆成功。     

芦丁-α-鼠李糖苷酶基因的克隆

根据芦丁 α 鼠李糖苷酶N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidiasp.R9g的总RNA出发,通过逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)扩增出芦丁 α 鼠李糖苷酶基因片段。将RT PCR获得的1条1.6kb的目的条带与pMD18 T载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞。酶切鉴定结果表明目的片段克隆成功。     

两种菌产两种不同天然苷类α-鼠李糖苷酶的研究

采用TLC法和分光光度计法研究了Absidia sp．G3g产人参皂苷-α-鼠李糖苷酶（RhaG）和Absidia sp．R9g产芦丁-α-鼠李糖苷酶（RhaR）的酶反应特性。实验结果表明,RhaG只水解人参皂苷Re的C-6位末端上的一个α-鼠李糖基,而RhaR能水解芦丁、橙皮苷、柚皮苷的α-鼠李糖基。两种酶反应条件中相同之处是酶反应最适底物质量浓度为1.0g／mL、最佳反应pH5．0,不同之处是RhaG反应的最佳反应温度是50℃,而RhaR则为40℃。     

两种菌产两种不同天然苷类α-鼠李糖苷酶的研究

采用TLC法和分光光度计法研究了Absidia sp.G3g产人参皂苷-α-鼠李糖苷酶(RhaG)和Ab-sidia sp.R9g产芦丁-α-鼠李糖苷酶(RhaR)的酶反应特性。实验结果表明,RhaG只水解人参皂苷Re的C-6位末端上的一个α-鼠李糖基,而RhaR能水解芦丁、橙皮苷、柚皮苷的α-鼠李糖基。两种酶反应条件中相同之处是酶反应最适底物质量浓度为1.0 g/mL、最佳反应pH 5.0,不同之处是RhaG反应的最佳反应温度是50℃,而RhaR则为40℃。     

人参皂甙Rg3的分离提纯

研究了人参皂甙Rh2生产过程中所生成的副产品Rg3的分离提纯。用硅胶柱层析法从人参皂甙混合中分离出单体Rg3的得率为样品的16%。再用化学法对Rg3进行拆分。20（S）-和20（R）-Rg3异构体，通过乙酰化反应生成极性相差较大的异构体，经硅胶柱层析得到两种产物，分别脱乙酰化后得到20（S）-Rg3和20（R）-Rg3。20（R）-Rg3收率为55%。     

人参皂甙Rg3的分离提纯

研究了人参皂甙Rh2生产过程中所生成的副产品Rg3的分离提纯。用硅胶柱层析法从人参皂甙混合物中分离出单体Rg3的得率为样品的 16 %。再用化学法对Rg3进行拆分。 2 0 (S) 和2 0 (R) Rg3异构体 ,通过乙酰化反应生成极性相差较大的异构体 ,经硅胶柱层析得到两种产物 ,分别脱乙酰化后得到 2 0 (S) Rg3和 2 0 (R) Rg3。 2 0 (R) Rg3收率为 5 5 %。     

人参皂甙β-糖苷酶的基因结构

为了研究人参皂甙 β 糖苷酶的基因结构 ,根据人参皂甙 β 糖苷酶的氨基酸N 末端序列设计了RT PCR引物 ,应用氯化铯密度梯度离心法提取了菌体总RNA ,以JFX0 1为模板进行RT PCR反应得到一条 1.0kb的基因 ,并对该基因进行了克隆测序。该测序结果与已知蛋白的基因无同源性 ,说明所得到的人参皂甙 β 糖苷酶的基因很有可能是新的基因     

人参皂甙组分的分离方法

人参的主要活性成分人参皂甙有人参二醇类皂甙、人参三醇类皂甙和齐墩果酸皂甙３种，其中药物活性较高的微量皂甙Ｒｇ３可由人参二醇类皂甙转化而来。为得到人参二醇类皂甙，用硅胶柱法成功地从人参总皂甙中分离出三醇类皂甙、二醇类皂甙和齐墩果酸皂甙。３种洗脱剂对二醇类皂甙（含齐墩果酸）的收率为２３．５％、３５．３％和２５．６％。混合二醇类皂甙经水解再硅胶柱分离的方法可得到混合皂甙质量的３０％Ｒｇ３，使制取大量的Ｒ     

芦丁鼠李糖苷酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

芦丁鼠李糖苷酶目的基因亚克隆至pPIC9K表达载体，电转化至毕赤酵母GS115中，进行了基因表达研究．结果表明，该转化宿主菌在甲醇诱导培养至144h．表达产蛋白具有芦丁鼠李糖苷酶活性，运用SDS-PAGE电泳技术确定其分子质量为53ku，与理论值基本相符．     

人参皂甙β—糖苷酶的基因结构

为了研究人参皂甙β-糖苷酶的基因结构,根据人参皂甙β-糖苷酶的氨基酸N-末端序列设计了RT-PCR引物,应用氯化铯密度梯度离心法提取了菌体总RNA,以JFA01为模板进行RT-PCR反应得到一条1.0kb的基因,并对该基因进行了克隆测序,该测序结果与已知蛋白的基因无同源性,说明所得到的人参皂甙β-糖苷酶的基因很有可能是新的基因。     

两种人参皂苷糖苷酶的酶性质比较

利用DEAE-Cellulose DE52离子交换柱层析法及电泳法对由菌株Absidia sp.G8r在发酵培养中产生的人参皂苷糖苷酶(Glc8)和Absidia sp.G4r在发酵培养中产生的人参皂苷糖苷酶(Glc4)进行了分离纯化,并采用TLC法和分光光度计法对其酶反应条件和酶反应特性进行了比较.结果显示,两种酶的分子质量均在71～72 ku,最适酶反应pH是5.0,最适酶反应温度30 ℃,金属离子K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Ca2+对酶反应的影响不大,Cu2+对人参皂苷糖苷酶有很明显的抑制作用.两种酶均具有专一性水解母环侧链末端的α-Gal、β-Glc键的特异性.实验结果表明,两种菌种产的两种人参皂苷糖苷酶是同一种人参皂苷糖苷酶.     

芦丁鼠李糖苷酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

芦丁鼠李糖苷酶目的基因亚克隆至pPIC9K表达载体,电转化至毕赤酵母GS115中,进行了基因表达研究.结果表明,该转化宿主菌在甲醇诱导培养至144 h,表达产蛋白具有芦丁鼠李糖苷酶活性,运用SDS-PAGE电泳技术确定其分子质量为53 ku,与理论值基本相符.     

RP-HPLC测定舒胸片中人参皂甙Rg1的含量

运用反相高效液相色谱对舒胸片中的有效成分人参皂甙Rg1进行了分离,并对其进行了含量测定,建立了反相HPLC测定舒胸片中人参皂甙Rg1的含量的方法.色谱柱:AlltimaC18(250mm×4.6mm,5μm),流动相:乙腈水(0.05%磷酸)=2575,流速:0.9mL/min,检测波长:203nm,柱温:35℃.平均回收率为96.5%,RSD为1.40%.