Vero细胞森林脑炎疫苗毒种的选育及其生物学特性检测

目的选育Vero细胞森林脑炎疫苗适应毒种。方法将森林脑炎疫苗鼠脑病毒“森张”株在Vero细胞上连续传代适应,并对不同代次收获的病毒液的病毒滴度、免疫原性、稳定性等进行检测。结果“森张”株病毒在Vero细胞上传代适应后,病毒滴度达8·5LgLD50/ml;免疫血清中和抗体效价高于1∶20,其它检测项目均符合疫苗生产用毒种的要求。结论Vero细胞适应的“森张”株毒种的初步特性显示可作为制备Vero细胞森林脑炎疫苗用毒种。     

3种乙型脑炎纯化疫苗免疫原性和热稳定性

目的比较地鼠肾细胞、Vero细胞和2BS细胞乙型脑炎纯化疫苗的免疫原性和热稳定性。方法对3种细胞制备的病毒原液和冻干疫苗分别进行小鼠免疫原性试验和热稳定性试验。结果2BS细胞制备的病毒原液和疫苗小鼠效力均高于地鼠肾细胞和Vero细胞;Vero细胞和地鼠肾细胞制备的病毒原液和疫苗小鼠蚀斑减少中和试验抗体效价均高于2BS细胞。3种细胞制备的疫苗在37℃保存4周,中和抗体效价损失均小于5%。结论3种细胞制备的病毒原液及冻干疫苗均具有良好的免疫原性及热稳定性。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性

目的探讨Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性。方法用Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分别以0.01、0.1和1MOI接种Vero细胞,进行传代培养,共传13代。采用微量细胞病变法测定病毒滴度;双抗体夹心法测定D抗原含量;免疫Wister大鼠,采用微量中和试验测定病毒的免疫原性。结果Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型在Vero细胞上连续传13代,病毒滴度基本稳定;D抗原含量呈下降趋势;免疫原性下降迅速。结论用Sabin株脊髓灰质炎病毒制备灭活疫苗,在Vero细胞上传代的代次越低越好。     

国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在健康人群中的安全性及免疫原性

目的评价国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在10~60岁健康人群中的安全性和免疫原性。方法采用随机、盲法、同类制品平行对照的设计,将900名受试者按2∶1随机配对分别接种试验疫苗及对照疫苗,观察安全性;所有受试者于首剂免前和免后14及45 d采集静脉血,通过快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)测定血清中狂犬病病毒中和抗体滴度,计算几何平均浓度水平(GMC)。结果试验组与对照组不良反应发生率分别为32.33%和38.67%,试验组明显低于对照组(P0.05)。局部反应主要为接种部位疼痛、发红、肿胀、瘙痒,全身反应主要为发热、头痛、乏力等,大部分为轻度(1级)。免后14、45 d试验组的狂犬病病毒中和抗体阳转率均为100.00%,抗体GMC分别为9.96和28.83 IU/m L,且与对照组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)具有良好的安全性和免疫原性。     

以重配技术制备H1N1流感病毒Vero细胞适应株

目的以重配技术制备H1N1流感病毒Vero细胞适应株,为以Vero细胞为基质生产流感疫苗奠定基础。方法以流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)为母本株,与WHO推荐的2007～2008年度北半球流感疫苗生产用毒株A/Caledonia/20/99(H1N1)共同感染SPF鸡胚和Vero细胞,用抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)抗体筛选重配病毒,在Vero细胞连续传12代,采用血凝抑制试验和RT-PCR鉴定病毒型别。将重配病毒经Vero细胞大量培养,重配前的病毒经鸡胚大量培养,分别经甲醛灭活,制备灭活疫苗,免疫ICR小鼠,检测其免疫原性。结果获得了1株Vero细胞适应的高产H1N1流感病毒株,连续传9代后,病毒血凝滴度维持在512,免疫原性与重配前的毒株相比,差异无统计学意义。结论通过流感病毒Vero细胞适应株与流行株的重配和抗体筛选,可以获得H1N1流感病毒Vero细胞适应株。     

水痘-带状疱疹病毒在Vero细胞中的传代培养及抗水痘血清的制备

目的在Vero细胞中传代培养水痘-带状疱疹病毒(varicella-herpes zoster virus,VZV),并制备抗水痘血清。方法将VZV(北京株VZV84-2)在Vero细胞中传代培养,待细胞病变(CPE)稳定后制备抗原,分别免疫家兔(分为1组和2组)和豚鼠(仅1组),均免疫4次,每次间隔14 d,其中除家兔1组第3、4次免疫经耳静脉注射不含佐剂的免疫原外,其他均经背部皮下免疫含弗氏完全佐剂的免疫原。于末次免疫后2周经颈动脉采血,分离血清,进行无菌试验、中和抗体效价检测及特异性干扰试验。结果 VZV(北京株84-2)在Vero细胞中传至第5代时,CPE可达80%~90%,传至第10代时,CPE稳定。用含兔及豚鼠血清培养基制备的免疫原的蛋白含量分别为2.1和1.7 mg/ml。抗血清无菌检测合格;家兔1组、豚鼠组、家兔2组的血清中和抗体效价分别为1∶128、1∶256、1∶64;抗水痘血清对麻疹(沪191株)、腮腺炎(S79株)、风疹(BRDⅡ株)疫苗的滴定无干扰。结论成功将VZV在Vero细胞中进行传代培养,并制备了抗水痘血清,但效价较低,有待进一步提高。     

我国黄热疫苗株病毒结构基因片段遗传特征的分析

目的分析中国使用的黄热疫苗株病毒结构基因片段的遗传特征。方法从我国使用的黄热疫苗病毒中提取RNA,对病毒结构基因片段进行扩增及测序,将测序结果与GenBank中黄热病毒Asibi株及黄热病毒疫苗株17D-204和17DD相应的核苷酸序列进行比较。结果中国黄热疫苗株在基因分子水平上具有17D疫苗株的基本减毒特征,与17DD株不同,与17D-204株更为相近。结论中国黄热疫苗株源自17D-204株,是安全有效的减毒株,且具有自身特有的遗传特征。     

CA16疫苗候选株特异性免疫血清保护性的初步评价

目的评价CA16 K168/8疫苗候选株免疫血清对不同CA16毒株的交叉中和能力及对致乳鼠麻痹CA16临床分离株的体内中和保护能力。方法将CA16 K168/8疫苗候选株病毒纯化液辅以弗氏佐剂经背部及侧腹部皮下多点注射免疫新西兰大白兔,制备高效价免疫血清。采用微量细胞病变法检测中和抗体效价;用中和抗体效价终浓度为32 U的特异性免疫血清对18株不同CA16临床分离毒株及15株EV71毒株进行交叉中和指数检测;选取中和抗体效价为16、32、64、128、256 U的特异性免疫血清对可致乳鼠产生明显麻痹作用的CA16 FY-18株进行体内中和保护水平检测。结果获得的兔抗CA16 K168/8血清对14株CA16毒株的中和效价为1∶1 024~1∶6 144,GMT值为1∶3 153;可于体外完全中和18株不同CA16毒株,中和指数为100~5 623.4,平均值为794.1,而对15株EV71临床分离株中和指数仅为0.32~5.62,平均值为2.2;体内中和保护水平随抗体效价升高而增加,呈量-效关系,当中和抗体效价达128 U时,可完全保护乳鼠不发生临床麻痹反应。结论 CA16 K168/8疫苗候选株特异性免疫血清体内、外试验结果表明其具有良好的免疫保护性。     

鸡胚细胞制备17D黄热疫苗

目的应用鸡胚细胞制备17D黄热疫苗。方法细胞与病毒同时接种,选择病毒增殖的适宜条件,收获病毒液,加入稳定剂,制备成冻干鸡胚细胞黄热疫苗,并进行鉴别试验、病毒滴定和疫苗保护力试验。结果病毒增殖的最适MOI为0.00046PFU/cell;最适培养温度为37℃;第2天洗换,第4天收获更合适;最适病毒感染细胞数为6.80×105～7.00×105个/ml。病毒感染鸡胚细胞后,滴度可达6.15～6.97LgPFU/ml。疫苗主要指标均达到《中国生物制品规程》(2000版)和WHO对疫苗的要求。免疫小鼠45d后,用卵黄囊疫苗4×103PFU脑内攻击,小鼠全部存活。结论在适宜的条件下,用鸡胚细胞制备17D黄热疫苗,能达到WHO疫苗人用标准。鸡胚细胞有取代鸡胚卵黄囊制备黄热疫苗的可能。     

轮状病毒基因重配株LD_9(G_2型)Vero细胞适应株的选育及其生物学特性

目的探讨轮状病毒基因重配株LD(9G2型)在Vero细胞上的传代适应性,选育高滴度的适应株。方法将3个轮状病毒基因重配株LD9克隆株(G2型)(LD9-1、LD9-2、LD9-3)在Vero细胞上分别以0.05、0.10、0.15和0.20MOI传代,选育出1株Vero细胞适应株,并确定其最适MOI,然后在Vero细胞上连续传代15代,检测病毒滴度及基因组核酸带型,采用nestRT-PCR法扩增其VP7基因。取第8、10、13代适应株病毒,以0.10MOI接种于Vero细胞,观察病毒的增殖动态。结果选育出的LD9-2株以0.10MOI接种Vero细胞可产生明显的细胞病变(CPE),病毒滴度随传代次数的增加先下降后升高,至4代时最低,9代后稳定于6.75lgCCID50/ml左右;连续传代15次,病毒基因组核酸带型均与原始毒株一致,且均能扩增出502bp的VP7基因。LD9-2株病毒增殖高峰期均出现在第7～8天,病毒滴度为6.00～7.00lgCCID50/ml。结论轮状病毒基因重配株LD9株(G2型)经Vero细胞适应性培养,获得了病毒表达量高且能稳定传代的疫苗候选株。     

肠道病毒71型Lanzhou01株的分离及其生物学特性

目的对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)Lanzhou01株进行分离、鉴定,并分析其生物学特性,为EV71疫苗候选毒株的筛选奠定基础。方法从兰州市手足口病患者的粪便样本中分离EV71,经蚀斑克隆传代后,RT-PCR法检测其特异性;Vero细胞甲基纤维素蚀斑法分析病毒的毒力;克隆病毒的VP1基因,进行序列测定及分析;扫描电镜观察病毒的形态;以不同的MOI接种Vero细胞,观察细胞病变,并绘制病毒的增殖曲线;连续传代,分析VP1基因和氨基酸序列,并测定毒力,检测其遗传稳定性。结果经细胞传代和蚀斑克隆,获得增殖性能稳定的分离株,RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析可见约250bp的特异性条带;经VP1基因测序与进化树鉴定为EV71,其与浙江、深圳等地的EV71分离株的核苷酸序列同源性均大于99%,属于C4基因亚型;电镜下观察病毒颗粒为球形,直径20～30nm;该病毒在Vero细胞上培养后产生典型的细胞病变,毒力为6.8LgPFU/ml;经Vero细胞连续传30代,不同代次的病毒VP1基因序列的核苷酸序列同源性大于或等于99.6%,氨基酸序列几乎没有明显变异,毒力也无明显改变。结论已成功分离1株EV71,其生物学特性良好,为灭活疫苗的研制及疫苗候选株的筛选奠定了基础。     

SARS病毒NS-1株三级毒种库的建立

目的建立SARS病毒NS1株三级毒种库。方法SARS病毒NS1株在Vero细胞上传代扩增,并经各项检定合格后,建立SARS病毒NS1株三级毒种库。结果工作种子批病毒滴度均在8.2LgCCID50ml以上;无菌试验、支原体检查均合格;鉴别试验中,经与SARS病人恢复期高效价血清中和,中和指数均在955以上;外源因子检查中,小鼠和乳鼠存活率均在86%以上;血吸附和非血吸附检查均为阴性;免疫原性检查中,病毒原液和1∶5倍稀释病毒液免疫小鼠,其血清中和效价分别达1∶54和1∶15。结论SARS病毒NS1株各项指标均符合《SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点》和《中国生物制品规程》2000年版要求,可作为SARS灭活疫苗生产用毒种。     

乙型脑炎灭活疫苗Vero细胞适应毒种的研究

将乙脑P3株鼠脑毒种在Vero细胞中适应性传代，当传至10代时，毒种的CPE和感染性虽无明显变化，但其免疫原性却明显减弱，因此，用在Vero细胞中传递1至2代的几株建立毒种库（P3V1和P3V2），其涵度分别为7．71和78210gpfu／ml。在毒种中加入以山梨醇为主要成分的稳定剂后，4～S℃保存30天，－30℃1年，－60℃2年，滴度降低约0．51ogpfu／ml，在生产中使用效果良好。     

鼬獾狂犬病病毒分离株的培养及其免疫原性

目的对分离的鼬獾狂犬病病毒BHK-21细胞适应株进行毒力和免疫原性检测,为兽用狂犬病疫苗的生产奠定基础。方法将分离获得的鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在BHK-21细胞上连续传代,采用直接免疫荧光法测定病毒滴度(TCID50);PCR法检测外源病毒和支原体。以β-丙内酯灭活病毒液,将灭活的病毒液免疫犬,采用FAVN法检测狂犬病病毒中和抗体水平,分析其免疫原性。结果鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在体外培养至130代时,病毒滴度可达1.0×107.75 TCID50/ml;未从狂犬病病毒JX08-45株中扩增出犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、腺病毒和支原体的特异性核酸;灭活的病毒液接种犬后产生的中和抗体可持续1年以上,且均在0.5 IU/ml以上。结论鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45经BHK-21细胞传代适应性较好,病毒滴度较高,且具有较好的免疫原性,已具备制备疫苗的基本条件。     

大流行流感疫苗毒种(NIBRG-14)的传代稳定性

目的观察大流行流感疫苗生产用毒种(NIBRG-14,E2代)的传代稳定性,为制定毒种传代限定次数提供依据。方法毒种通过SPF鸡胚传代,检测不同代次毒种的生物学指标,并对传代后的遗传稳定性指标,即关键基因(血凝素和神经氨酸酶)和其他基因进行测序分析。结果毒种经连续传代至E12代,各项生物学指标均保持良好的稳定性,E3～E12代病毒感染性滴度均不低于8.54lgEID50/ml,血凝滴度均不低于1∶256,E3、E4及E12代病毒间的HA基因序列均保持一致,基因中被删除的高致病区域的核苷酸序列保持稳定,NA等基因序列在传代过程中也保持一致。结论大流行流感疫苗生产用毒种(NIBRG-14,E2代)连续传10代(至E12代),其生物学和遗传稳定性良好。     

Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的接种反应及免疫效果观察

目的观察Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的接种反应及免疫效果。方法选择乙脑低发区黑龙江省肇源县8月龄～10岁常住健康儿童为观察对象,按照免疫程序分别接种辽宁成大生物股份有限公司生产的Vero细胞乙脑灭活疫苗(A组∶水针剂型;B组:冻干剂型)和市售乙脑灭活疫苗(对照组),观察接种后的不良反应,并采用蚀斑减少中和试验(PRNT)法检测血清乙脑中和抗体。结果A、B组疫苗的总不良反应率为2.81%,对照组为6.63%,3组均未出现严重不良反应,发热反应以轻度为主,局部不良反应较轻微,72h后全部消失。免疫后血清中和抗体阳转率A组为93.3%,B组为90.4%,对照组为81.8%;GMTA组为1∶24.0,B组为1∶21.8,对照组为1∶15.4。A组、B组的中和抗体阳转率和GMT均显著高于对照组,差异有统计学意义,3组之间中和抗体滴度的分布差异无统计学意义。结论辽宁成大生物股份有限公司生产的Vero细胞乙脑灭活疫苗不良反应率低,免疫效果良好。     

伤寒、副伤寒甲沙门菌毒性和抗原性的稳定性

目的观察伤寒Vi多糖结合疫苗生产用菌株伤寒沙门菌CMCC50098株和副伤寒甲沙门菌CMCC50073株毒性和抗原性的稳定性。方法将CMCC50098和CMCC50073菌株分别连续传代至30代,取3、5、10、15、20、25、30代次菌,进行小鼠毒性试验,免疫家兔制备血清,进行抗原性试验。结果CMCC50098和CMCC50073菌株连续传30代,毒性均未改变,抗原性均未下降,血清凝集效价均达到1∶12800。结论CMCC50098和CMCC50073菌株连续传代至30代,毒性及抗原性均稳定。