小麦蛋白质二硫键异构酶基因的克隆、表达及重组酶性质

目的:克隆小麦蛋白质二硫键异构酶(wheat protein disulfide isomerase,wPDI)基因,实现其在大肠杆菌中的表达并探究其酶学性质。方法:以小麦种子总RNA为模板,逆转录并扩增得到wpdi,并以pET-30b为表达载体、大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌进行原核表达,表达产物经金属螯合层析纯化后进行了酶学性质研究。结果:克隆的基因全长1 548 bp,与"Wyuna"品种小麦wpdi基因相似性达99%。构建了pET-30b-wpdi表达载体,获得w PDI的最佳表达条件为:诱导温度22℃,诱导时间6 h,诱导剂浓度0.5 mmol/L。该酶含4个硫氧还蛋白结构域,分子质量约为66.2 kD,具有二硫键的还原酶和异构酶活性以及分子伴侣活性。结论:对重组wPDI的表达和酶学性质研究,为wPDI在面制品加工及其他方面的应用提供参考依据。     

耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将一种11家族极端耐热木聚糖酶的密码子优化基因Syxyn11克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-Syxyn11,将其经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经G418筛选得到重组工程菌GS115/Syxyn11,用甲醇诱导表达重组木聚糖酶SyXyn11,酶活可达到17.74 U/mL。SDS-PAGE显示,SyXyn11的相对分子质量为31 000。SyXyn11的最适反应温度为85℃,在80℃以下稳定。最适反应pH为6.5,在pH 5.0~7.5范围内稳定。EDTA和大多数金属离子对重组酶的活性影响不大。结果表明Syxyn11成功在P.pastoris GS115中实现表达,而且重组木聚糖酶的耐热性并未改变。     

蛋白质谷氨酰胺酶在毕赤酵母中的异源表达

蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase, PG)可水解蛋白质侧链的谷氨酰胺残基,生成氨和蛋白质-L-谷氨酸,从而增加负电荷、降低蛋白等电点,进而改善蛋白质的功能特性。但其生产菌株解朊金黄杆菌的产酶量较低,仅有0.258 U/mL,且基因操作效率低,故近年来多采用异源表达的方法,以提高其产量。该实验成功实现蛋白质谷氨酰胺酶酶原(Pro-PG)在毕赤酵母GS115中异源表达,还进行了培养基优化及重组酶学性质的研究。结果表明：重组毕赤酵母pPIC9K-Pro-PG/GS115在摇瓶水平经1%(体积分数)甲醇诱导120 h,表达出的Pro-PG经胰蛋白酶加工后,PG酶活力达到0.878 U/mL。酶学性质研究发现,重组的PG最适作用温度为60℃,在不超过60℃时孵育1 h其相对酶活力可保持在80%以上;该酶作用的最适pH为6.0,在pH 3.0～8.0条件下孵育1 h其相对酶活力可保持在70%以上。     

Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因sph在毕赤酵母中的表达及重组酶酶学性质

将Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因sph进行毕赤酵母密码子优化后,进行全基因合成,并构建了重组酵母菌P. pastoris X33-ppicZalphA-sph,对重组酶进行酶学性质研究。结果表明,重组酶的最适反应温度和最适反应pH为40 ℃和8.0,且其为20~30 ℃中保温10 h仍有80%以上的酶活力、在pH7.0~9.0条件下孵育24 h,仍能保持60%以上的酶活性。K+、Sr2+对酶活有明显激活作用,而Fe3+、Ba2+对酶活有明显抑制作用;重组蛋白酶SPH在极性常数为0.8~3.1的25%的正丁醇、环己烷、二甲苯中孵育6 d后,仍能保留50%以上的酶活性。本研究为B. phaericus 2297和B. phaericus DS11蛋白酶有机溶剂耐受性机制的研究奠定基础。     

Streptomyces septatus磷脂酶D在毕赤酵母中的重组表达及酶学性质分析

以Streptomyces septatus TCCC 21057基因组为模板,扩增得到磷脂酶D(phospholipase D,PLD)基因(pld),经合成获得pld密码子优化基因(pldm),以pPIC9K为表达载体,毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为宿主菌株,构建获得毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-pldm,摇瓶发酵后获得的重组PLD(rPLDM)转酯活力达2.37 U/mL;rPLDM经纯化后进行转酯酶学性质分析,其最适作用温度为60℃,最适作用pH值为6.5;在单水相反应体系中,40℃、pH 6.5、Ca²⁺浓度10 mmol/L、大豆磷脂酰胆碱和L-丝氨酸物质的量比1∶10、rPLDM添加4.0 U/mL,反应6 h后,磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)的产率可达到33%。本研究通过对rPLDM的重组表达、转酯酶学性质及催化合成PS的研究,为进一步实现酶法合成新资源食品PS奠定了基础。     

产胆固醇酯酶毕赤酵母发酵条件优化及酶学性质研究

为实现胆固醇酯酶的高效发酵,以成功表达的毕赤酵母工程菌株P.pastoris X-33为研究对象,通过单因素和正交试验对其发酵条件进行优化.结果表明:最适培养基组成为:酵母浸粉含量1.0％、蛋白胨浓度1.5％、甘油含量1.0％、KH2PO41.18％、K2HPO40.3％、生物素4×10-5％、YNB 1.34％;在初...     

碱性木聚糖酶在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

将教酒链霉菌L1105第10家族碱性木聚糖酶基因去除纤维素结合域(CBD)后将功能结构域基因xynAe SC克隆到毕赤酵母表达载体。经筛选得到重组工程菌GS1153-20,用甲醇诱导后产酶活力达到最高683±9U/m L。结果表明,重组木聚糖酶的最适p H为7.2,且在p H 6.2~8.6有较高的相对酶活;其最适温度为70℃,40~60℃时相对酶活力都在70%以上;重组酶Xyn Ae SC以燕麦木聚糖为底物时,酶活力最高,相对酶活力为桦木的259.7%±10.7%;对甘蔗渣木聚糖的酶活力最低,只有对桦木木聚糖酶活的16.0%±1.5%。研究表明,碱性木聚糖酶基因成功地在毕赤酵母中表达,且去除CBD域后,其酶学性质并未改变。     

黑曲霉内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达及应用研究

利用PCR方法从黑曲霉（Aspergillus niger）基因组DNA中扩增内切菊粉酶（endo I）全长基因（1551 bp）,经序列分析后将其连接到表达载体p PIC9K上,得到重组表达载体p PIC9K-endo I。重组质粒经Sac I线性化并电转化到毕赤酵母GS115,阳性转化子进行发酵产酶后考察其酶学性质。酶学性质研究表明,重组酶的最适p H和最适温度分别为5和60℃,重组酶在55℃下保温9 h后,重组菊粉内切酶仍残余83.2%的活性,表现出极高的热稳定性,Cu²⁺、Ag⁺对重组酶有明显的抑制作用。对内切菊粉酶水解菊粉的过程研究表明,重组内切菊粉酶能在8 h内将4%（w/v）菊粉水解为3⁶个聚合度的低聚果糖,水解11 h后,低聚果糖得率达到63.5%,本研究为进一步开发以菊粉为原料生产低聚果糖的应用奠定了基础。      

展示在毕赤酵母表面稻米脂肪酶的性质研究

人工合成酵母菌壁蛋白(GCW14)与稻米脂肪酶(RL)组合基因(GCW14-RL),将其亚克隆到pPIC9k载体后转化到GS115酵母菌中,成功构建了pPIC9k-GCW14-Rlipase载体,并将RL展示在毕赤酵母GS115表面;同时对其酶学性质进行研究,发现其在30~45℃的温度范围都能发挥作用,最适pH为8.0,重复使用5次依然可以保持80%以上的活性。     

毕赤酵母单宁酶工程菌在固、液发酵中的性质差异分析

探究固、液发酵方式在重组毕赤酵母单宁酶工程菌的形态、产酶量及酶学特性等方面的差异。研究发现,重组菌株在固、液发酵方式下表现出了较大差异。固态发酵条件下,重组菌株能够积累更多的生物量,当培养48 h后积累的生物量比液态发酵高22.3%;经电镜分析发现,固态条件下,重组菌株个体之间更容易出现聚集,并伴随着有生物膜的产生;在不同甲醇体积分数诱导下,固、液发酵的重组菌株的产酶量均出现了先升高后降低的趋势,而诱导两者最高产酶量的甲醇体积分数却存在差异,分别是2%和3%。进一步研究发现,固、液发酵条件下,重组菌株发酵的单宁酶酶学性质也存在一定差异,固、液态发酵单宁酶的最适反应温度分别为30 ℃和为20 ℃,且酶的热稳定性也有一定提高,其余酶学性质差异不显著。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析发现,固态发酵生产的单宁酶存在不同的修饰,这可能是造成上述性质差异的原因之一。综上所述,本研究探究了固、液发酵条件下,重组单宁酶毕赤酵母菌株生长及产酶特性的差异,为高效制备单宁酶提供了一定的理论指导。     

甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的分泌表达

本研究采用毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度Monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9M,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度Monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M.通过PCR检测证实Monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Western blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白存在正常活性.     

重组牙鲆生长激素基因片断在毕赤酵母中的表达

为了开发一种有效的重组牙鲆生长激素(r-fGH)的方法,利用PCR的方法从牙鲆eDNA文库中克隆得到了牙鲆生长激素(fgh)的cDNA片断.接着将这个fgh片断克隆到整合型质粒pAO815,它可以在甲醇诱导启动子的调控下表达外源蛋白.利用这种包含一个fgh插入片段的克隆来构建含有2个和3个头尾顺序排列的fgh表达框的表达质粒.利用氯化锂转化的方法将所构建的质粒转化到毕赤酵母GS115,然后进行筛选、培养和0.5%甲醇诱导表达,最后得到重组表达的牙鲆生长激素.     

从毕赤酵母中提取外源重组蛋白的超声破碎条件及优化

建立适用于从毕赤酵母菌中提取外源重组蛋白的超声破碎方法。采用Western Blotting免疫印记技术检测从毕赤酵母菌中提取的外源人脂联素蛋白活性,并以外源人脂联素蛋白活性作为考察指标,采用单因素和L9(33)正交试验设计,对超声破碎条件进行优化。结果表明：在外源人脂联素蛋白活性最高的情况下,超声破碎条件为超声破碎功率450W、时间25min、时间间隔(工作时间:间歇时间)10:10(s/s),此时细胞破碎率为(67.8±2.1)%。若在超声破碎时添加1mmol/L PMSF,虽对细胞破碎率并无显著影响,但外源人脂联素蛋白活性将会明显增高。     

Expression and purification of goat lactoferrin from Pichia pastoris expression system

ABSTRACT:  The recombinant goat lactoferrin (rGLF) was expressed in the methylotropic yeast Pichia pastoris using pGAPZαC vector, GAP as promoter, and Zeocin as the selective marker. After transformation of the GLF-pGAPZαC into Pichia pastoris X-33 expression host, the GLF-pGAPZαC vector was integrated into the GAP promoter locus of Pichia pastoris X-33 chromosome. The rGLF was expressed and secreted into the broth using α-factor preprosequence. SDS-PAGE and PAS staining analysis indicated that the rGLF could be purified to electrophoretic homogeneity by heparin-Sepharose 6 Fast Flow affinity chromatography and glycosylated by the expression host. The yield of purified rGLF was approximately 2.0 mg/L of culture broth. The N-terminal sequence was identical to the native goat lactoferrin (nGLF). The iron-binding behavior, papain-inhibiting property, and thermal stability of the purified rGLF were comparable to nGLF. This is the 1st report of intact goat lactoferrin expression using the P. pastoris system.     

牛凝乳酶原基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特性的研究

凝乳酶是制造干酪的关键酶。为获得高活性的牛凝乳酶（chymosin,B-chy）,用电脉冲法将线性化的pGAPZαA-B-pchy重组表达载体转化到毕赤酵母GS115中。该菌株在以葡萄糖为碳源的YPD培养基中可分泌表达牛凝乳酶原。SDS-PAGE分析表明所表达的牛凝乳酶,分子量约为37ku,符合预期大小。发酵培养96h后,酶活力达到96SU/mL。酶学特性分析表明,其最适凝乳温度为60℃,在pH2⁶、小于50℃的温度范围内稳定。Ca2+浓度为40mmol/L时,钙促酶反应活性达到最高,此后随着Ca2+浓度的增加酶活力逐渐降低。金属离子Al3+、Mn2+、Fe2+、Mg2+和K+对酶活力具有显著的促进作用,而Co2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+对酶活力具有显著的抑制作用。本研究优化了凝乳酶的表达条件,为凝乳酶工业化生产提供了理论基础。      

人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析

胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。     

一种通过过表达毕赤酵母翻译相关因子提高重组蛋白胞内表达的策略

本研究为筛选对毕赤酵母重组蛋白表达有促进作用的翻译相关因子,扩增了毕赤酵母中包括核糖体蛋白翻译起始因子、翻译延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、核糖体生物合成因子、核糖体分子伴侣五类翻译相关因子(共28个)的基因片段,并将上述基因片段与质粒pPICZA进行同源重组,进一步获得重组载体后分别转化至以增强型绿色荧光蛋白eGFP...     

分子伴侣共表达对重组蔗糖异构酶异源可溶性表达的影响

蔗糖异构酶(sucrose isomerase,SIase)在异麦芽酮糖的酶法制备中发挥着重要作用。为了提高重组蔗糖异构酶的可溶性表达,作者利用分子伴侣共表达策略将源自Klebsiella sp.LX3的基因SIase进行异源表达并研究了重组酶的酶学性质。利用酶切连接技术构建重组质粒pET-24b-SIase并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达,发现其主要表达为包涵体。分别将携带4种分子伴侣蛋白基因的质粒(pKJE7、pGro7、pG-Tf2、pTf16)与含有目的基因的重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中共表达,筛选到最佳分子伴侣质粒pGro7且提高了重组SIase的可溶性表达水平,其酶活力为14.8 U/mL,比未进行共表达的工程菌发酵酶活力(3.5 U/mL)有明显提高,进一步利用金属离子螯合层析技术纯化到SIase纯酶,酶学性质研究显示其最适反应温度为40℃,最适反应pH为6.0。动力学常数K_m为(179.10±20.65) mmol/L、k_cat/K_m为(5.44±0.72)...