蛋清源ACE抑制肽结构鉴定及其稳定性

利用碱性蛋白酶酶解蛋清制备活性肽,采用交联葡聚糖凝胶色谱初步纯化具有血管紧张素转化酶抑制活性的组分,高活性组分通过液相色谱-四极杆线性离子阱串联质谱(LC-QTRAP)对纯化组分进行结构鉴定得到19个活性肽。分别对其中3个活性肽DHPFLF、HAEIN和QIGLF进行化学合成及活性测定,其中QIGLF的ACE抑制活性较高,IC50为75.00μM,对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有较强的抗酶解能力。     

低次烟叶蛋白肽抗氧化特性的研究

采用复合蛋白酶水解低次烟叶蛋白，产生的酶解物中蛋白肽根据其分子量大小进行了分离，在此基础上采用氧化亚油酸体系TBA法和DPPH自由基清除活性研究了不同肽组分的抗氧化活性。低次烟叶蛋白酶解液经超滤膜分级分离，得到透过10kDa、5kDa、3kDa和1kDa4种截留分子量膜的肽组分，其中透过5kDa的肽组分具有较高的抗氧化活性，其氧化抑制率为42．55％，是原蛋白酶解液活性的2倍左右，接近VE的抗氧化活性。透过5kDa的肽组分对DPPH自由基的清除活性最强（清除率达到83．82％），略低于VE的清除活性。试验结果袁明．低次烟叶蛋白经盆合蛋白酶酶解后产生的蛋白肽功能特性有明显的改善。     

蛋清源凝血酶抑制肽的纯化

为了制备安全性高、副作用小的凝血酶抑制肽,将蛋清Alcalase酶解产物经凝胶柱色谱Sephadex G-50凝胶柱色谱和半制备高效液相色谱纯化,旋转蒸发、冷冻干燥后经酶标仪法检测其抗凝血活性,筛选出高抗凝血活性的组分。结果表明:经Sephadex G-50纯化后的第4个组分即洗脱时间为35～40min的组分抗凝血活性最好,抑制率达到84.74%。将该组分通过半制备高效液相色谱纯化后得到12个峰,峰Ⅶ即洗脱时间为17.275～19.542min的组分活性最高,抑制率达到71.27%。     

花生蛋白制备ACE抑制肽的初步分离纯化研究

采用30 ku、10 ku、5 ku三级超滤将酶解液进行分离和浓缩。三级超滤的结果表明:10 ku的透过液的半抑制浓度(IC50)最低为1.32 mg/m L。采用葡聚糖G-15对酶解液10 ku的透过液进行脱盐和分组,结果表明:脱盐率达到了94.50%,花生多肽的回收率为78.23%。分离的4个峰中峰4的IC50最小为0.634 mg/m L,说明峰4的ACE抑制活性效果最好。将峰4的组分进行LCMS检测,得到ACE抑制肽主要的相对分子质量为1 193.5、1 512.6、1 530、1 608.9、1 777.6。     

鸡蛋清蛋白酶解肽的抗氧化活性

分别采用胃蛋白酶和碱性蛋白酶对鸡蛋清蛋白进行单酶和双酶水解,筛选得到水解度较高的鸡蛋清蛋白酶解产物Ⅰ(P-A)H,并对上述酶解产物依次进行超滤和树脂分离,得到高活性的组分ⅠF2。通过总还原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和羟自由基(·OH)抗氧化评价体系,分析酶解产物Ⅰ(P-A)H和组分ⅠF2的抗氧化能力。结果表明:Ⅰ(P-A)H具有较强的总还原力和DPPH清除力以及显著的·OH清除能力;组分ⅠF2与酶解产物Ⅰ(P-A)H的抗氧化活性相比,其活性显著性提高。     

海参水煮液中ACE抑制肽的分离纯化

采用大孔树脂吸附的方法对海参水煮液酶解物多肽进行分离。用30%、60%和90%乙醇水溶液依次洗脱,得到3种多肽。对所得多肽进行ACE抑制活性测定,发现其IC50分别为3.01、0.98和2.88mg/mL。应用Rp18反相硅胶柱和LH-20葡聚糖凝胶柱对活性最高的组分进行ACE抑制肽分离纯化,得到2种多肽单体,ACE抑制活性的IC50分别为0.74和1.77mg/mL。     

Purification and Identification of Antioxidant Peptides from the Scallop Skirts of Mimachlamys Nobilis

华贵栉孔扇贝裙边抗氧化活性肽的纯化与鉴定

王全富¹,王一帆¹,侯艳华¹ ,徐一凤¹,闫美宏¹,李昊远¹,刘远平²,李钰金³

（1哈尔滨工业大学（威海）,海洋科学与技术学院,山东 威海 264209,

2山东省海洋健康食品工程技术研究中心,山东 荣成 264300

3山东海洋功能食品发展联合实验室,山东 荣成 264300）

创新点说明：

1）本文利用含有丰富营养物质的加工副产物扇贝裙边进行了抗氧化活性肽的纯化相关研究。

2）本文利用多级纯化的方法与多种抗氧化活性评价方法测定了扇贝裙边抗氧化活性肽的分离与鉴定,最终获得了具有极高抗氧化能力的小分子生物活性肽。

3）本研究对于海洋生物活性肽的工业制备与实际生产开发与应用提供了重要的理论依据。

研究目的：

以华贵栉孔扇贝裙边为原料分离纯化得到抗氧化活性较高的生物活性肽。

研究方法：

利用5种蛋白酶酶解华贵栉孔扇贝裙边,筛选得到酶解液抗氧化能力最强的蛋白酶。以DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率与超氧阴离子自由基清除率为指标,利用超滤、凝胶柱层析、SDS-PAGE与反相高效液相色谱对扇贝裙边酶解液进行分离纯化,以获得高纯度抗氧化活性肽。利用质谱法鉴定最终纯化得到的抗氧化活性肽的分子量。

结果：

1）胰蛋白酶解扇贝裙边得到的酶解液的抗氧化活性最高,其DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率与超氧阴离子自由基清除率分别为75.6 %,79.5 %与76.7 %。

2）利用多级纯化得到的抗氧化活性肽命名为MNAP,其DPPH自由基清除率为85.7 %,质谱法测定MNAP的包含2个小肽,其分子量分别为2 855.6 Da与3 007.2 Da。

结论：

华贵栉孔扇贝裙边能够作为用于制备具有较强抗氧化能力的生物活性肽。

关键词：华贵栉孔扇贝;抗氧化活性肽;纯化;扇贝裙边;水解产物

     

谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及酶学性质

茂原链轮丝菌Streptoverticillium mobaraense所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液通过抽滤、超滤、乙醇沉淀、离心和冷冻干燥，制得粗酶粉的酶活约为1033U／g。对粗酶研究发现，该酶的最适反应温度为52℃，最适pH为6.0；粗酶的pH稳定范围在4－8，温度稳定范围在20－40℃，离子强度对该酶的活性稍有影响，粗酶经CM－纤维素层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析后得到较纯的酶，通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检验蛋白质纯度，得到较弱的单一区带，其中，CM－纤维素层析的纯化倍数为4.5，收率质量分数约为78.8%；凝胶过滤层析纯化倍数为1.11，收率质量分数为50％；用凝胶过滤法测得谷氨酰胺转胺酶的相对分子质量为40092。     

鸭蛋蛋清肽抗氧化性的研究

将鸭蛋蛋清水解得到蛋清肽,对其抗氧化性进行了研究。鸭蛋蛋清的水解方式有木瓜蛋白酶单酶水解和木瓜蛋白酶+中性蛋白酶分步水解,将所得水解物冷冻干燥后配成一定浓度溶液,测定其抗氧化性;同时对比将所得水解物进行脱盐处理再冷冻干燥后的抗氧化活性。结果表明,采用木瓜蛋白酶+中性蛋白酶对鸭蛋蛋清进行分步水解,且水解物不进行脱盐处理得到的水解物抗氧化活性最强,浓度为5mg/mL时对羟自由基清除率为24.16%,且表现出了一定的还原力,蛋清肽的抗氧化溶性随着浓度的增大而增强。     

碱性蛋白酶对鸡蛋清的酶解效果研究

试验以新鲜鸡蛋蛋清为原料,以水解度(DH)作为试验衡量指标,利用pH-stat法对底物浓度、pH值、酶解温度、加酶量、酶解时间等试验条件进行考察,并采用正交试验综合分析得到碱性蛋白酶酶解鸡蛋清制备蛋清肽的最佳工艺条件为:底物浓度4%;酶解pH值9.5;酶解温度55℃;加酶量6%;酶解反应时间4 h,水解度可达23.74%。     

萝卜红色素的稳定性和抗氧化性研究

萝卜红色素具有良好的稳定性,自然光和紫外光下均能保持稳定。低于80℃色素分解缓慢,100℃时色素分解明显加快,4h损失率达到50%。低pH值有利于色素的稳定,能耐更高的温度。金属离子对色素的稳定性影响显著,其中Fe^2＋和Fe^3＋有利于色素的稳定,但是容易和色素产生络合沉淀,Zn^2＋、Cu^2＋、Al^3＋使色素稳定性下降,促进色素的分解,Mg^2＋对色素的影响则不明显。抗氧化实验发现色素具有良好的清除自由基能力,对超氧阴离子、OH·和DPPH·的半自由基清除率（IC50）分别为0.31g/L、0.13g/L和9mg/L,总体抗氧化能力略强于抗坏血酸。     

玉竹多糖的抗氧化作用研究

为研究玉竹多糖的体外抗氧化活性和清除自由基作用,采用体外化学体系研究玉竹多糖对超氧阴离子（O2-·）、羟自由基（·OH）、1,1-二苯基_2苦苯肼自由基（DPPH·）和过氧化氢（H2O2）的清除能力。结果表明：玉竹多糖对超氧阴离子（O2-·）、过氧化氢（H2O2）和1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）具有较强的清除能力,其EC50值分别为0．38mg／mL（Vc为O．09mg／mL）、0．65mg／mL（Vc为0．70mg／mL）和0．43mg／mL（Vc为0．06mg／mL）;但对羟自由基（·OH）的清除能力较弱,其EC50值为14．7mg／mL（Vc为0．34mg／mL）。玉竹多糖具有较好的体外抗氧化活性。     

两种多糖复配物的抗氧化性研究

研究香菇、苦瓜两种多糖复配物的抗氧化性. 采用水提醇沉法获得香菇多糖、苦瓜粗多糖,用Sevage试剂除去蛋白质得到精多糖. 比较两种多糖及其复配物对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(·O^2-)、DPPH自由基的清除能力. 香菇多糖和苦瓜多糖复配比例为1:1、1:2、1:3、2:1、2:3、3:1、3:2. 实验结果表明,两种多糖及其不同比例复配物对3种自由基均具有良好的清除能力,当复配比为2:1时,复配物对羟基(·OH)、超氧阴离子(·O^2-)、DPPH 3种自由基的清除率的IC₅₀值分别为3.447、2.006、0.500 mg/mL,其清除效果优于两种多糖单独使用或其他比例复配时,此时其抗氧化能力最强.     

裂蹄木层孔菌总黄酮含量的测定及其抗氧化活性研究

利用体积浓度为70%的乙醇提取裂蹄木层孔菌中的黄酮类物质,以芦丁为对照品,利用紫外分光光度法测定裂蹄木层孔菌中的总黄酮含量,并研究了裂蹄木层孔菌中黄酮类化合物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除作用.结果表明:在510 nm处,芦丁浓度在0.002～0.040 mg/mL范围内线性关系良好(r=0.998 5),裂蹄木层孔菌中总黄酮含量为38.2 mg/g; 裂蹄木层孔菌中的黄酮类化合物对清除自由基有一定的作用,其清除效果在一定范围内随着总黄酮质量浓度的增加而增强.     

恒顺香醋乙酸乙酯萃取物DPPH自由基清除活性的研究

研究了恒顺香醋乙酸乙酯萃取物对DPPH自由基的清除活性.结果表明,清除活性较高的部分为乙酸乙酯酚性和酸性萃取物,半清除率分别为0.49 mg/mL、1.39 mg/mL.在乙酸乙酯酸性萃取物中以丙酮溶解物的自由基清除活性最高,半清除率为0.71 mg/mL.各活性部位对DPPH自由基的清除率与剂量相关.     

长白红景天提取物抗氧化活性的研究

为研究长白红景天的抗氧化活性,采用正交方法确定了长白红景天的最佳提取条件,在最佳条件下提取物的总黄酮含量为3.74%.对提取物进行DPPH、超氧负离子和羟基自由基清除测试显示,长白红景天提取物对DPPH、超氧负离子和羟基自由基均有较好的清除能力,并且在一定浓度范围内其清除效果优于Vc、TBHQ 和BHT; 因此,长白红景天是一种天然的优良抗氧化植物.     

五倍子醇提物的抗氧化活性

从还原力、清除DPPH自由基、清除超氧阴离子、清除羟自由基和抗脂质过氧化作用等方面研究了五倍子乙醇提取物的抗氧化活性,并同Vc或VE进行比较.实验结果表明,五倍子提取物对以上测定方法均表现出明显的抗氧化活性,其抗氧化活性均随其浓度的增加而增强.五倍子提取物和Vc(或VE)在同等浓度下,五倍子提取物的还原力和清除超氧阴离...     

五倍子醇提物的抗氧化活性

从还原力、清除DPPH自由基、清除超氧阴离子、清除羟自由基和抗脂质过氧化作用等方面研究了五倍子乙醇提取物的抗氧化活性,并同VC或VE进行比较。实验结果表明,五倍子提取物对以上测定方法均表现出明显的抗氧化活性,其抗氧化活性均随其浓度的增加而增强。五倍子提取物和VC(或VE)在同等浓度下,五倍子提取物的还原力和清除超氧阴离子的能力超过VC,清除DPPH自由基和清除羟自由基的能力低于VC,抗脂质过氧化的作用低于VE。五倍子醇提物有很高的抗氧化活性。     

石花菜多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究

利用水提醇沉法提取石花菜多糖（GAP）,通过单因素和正交实验考察了温度、时间、料液比和提取次数等因素对GAP提取率的影响。结果表明,GAP的最适宜提取工艺条件是：料液比为1g∶30mL,温度75℃,时间2h,提取3次。GAP对羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除实验表明,GAP具有良好的抗氧化活性,而且对2种自由基的清除能力强弱顺序是.OH〉O2-.。