基于16S rDNA序列、MALDI-TOF-MS和VITEK的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的鉴定

沙门氏菌和金黄色葡萄球菌广泛存在于食品及环境中,对食品安全造成一定的威胁。在食源性致病菌检测过程中,选择合适的方法不仅可以缩短时间,节省人力物力,还能更好地溯源。选取210株沙门氏菌和18株金黄色葡萄球菌,使用16S rDNA序列测定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和VITEK全自动细菌鉴定系统对其鉴定,使用R软件包(v3.6.1)对鉴定结果进行统计和相关性分析,比较3种方法的鉴定水平和效率。结果表明:3种方法均可将210株沙门氏菌(100.0%)鉴定到属水平;16S rDNA序列测定方法可将18株(100.0%)金黄色葡萄球菌鉴定到属水平,可将其中15株(83.3%)菌鉴定到种水平;MALDI-TOF-MS和VITEK可将18株金黄色葡萄球菌(100.0%)鉴定到种水平。除16S rDNA序列测定方法外,其余2种方法对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的鉴定水平相同,而MALDI-TOF-MS鉴定所需时间最短、效率最高。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在 李斯特菌检测和鉴定中的应用

为建立食品中各种李斯特菌的快速检测和鉴定方法,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对单增李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌和格氏李斯特菌5种李斯特菌进行检测,并与传统的生化鉴定方法(VITEK 2)和聚合酶链式反应(PCR)方法检测结果进行比较;用不同培养基和不同培养时间培养的单增李斯特菌对该方法进行检测,还对60份人工感染5种李斯特菌的食品样品分别进行MALDI-TOF-MS、PCR以及传统生化方法的检测和鉴定。结果表明：MALDI-TOF-MS能够快速、可靠地区分上述5种李斯特菌,而且具有很好的稳定性和重复性,在检测时间、重复性和准确性方面的总体表现优于传统生化鉴定方法。MALDI-TOF-MS技术适用于对李斯特菌等食源性病原菌进行高通量、低成本的快速鉴定。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术分离鉴定生鲜猪肉中沙门氏菌/大肠杆菌类似菌

目的利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术鉴别生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门氏菌的常规检验中出现的类似菌。方法在郑州市不同地区分批次采集164份生鲜猪肉样品,按照国标方法进行增菌培养,选择性培养基HE和EMB对细菌进行分离纯化。通过MALDI-TOF-MS技术对疑似菌落进行鉴定;提取被检菌株基因组DNA,根据MALDI-TOF-MS鉴定出的细菌种类,参考Gen Bank中相关菌株的已知基因序列分别设计引物,进行PCR扩增、测序和序列比对,以验证MALDI-TOF-MS鉴定结果。结果经MALDI-TOF-MS方法鉴定,从68个疑似菌株中分别检出柠檬酸杆菌(Citrobacter)6株、奇异变形杆菌(Proteobacteria)5株、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)9株、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)1株、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)3株、不动杆菌(Acinetobacter)1株。PCR结果与MALDI-TOF-MS鉴定结果完全一致。结论 MALDI-TOF-MS可用于生鲜猪肉检验过程中大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定。本次共检出6种在HE和EMB培养基上与沙门氏菌/大肠杆菌菌落特征类似的肠杆菌科其他细菌,说明在生鲜猪肉中存在着一定程度的条件致病性肠道细菌污染,因此具有一定的食品安全风险。     

食品中沙门氏菌快速检测技术方法对比结果分析

目的比较VITEK2COMPACT、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrixassistedlaser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)、实时荧光PCR法(real-time PCR)、环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)4类方法,分析其对沙门氏菌的快速检测效果。方法挑取12株阳性野生菌株复苏,配以1株标准菌株作为对照,分别用VIKEK2COMPACT、MALDI-TOF-MS、Real-timePCR、LAMP四类方法对其进行检测,并比较4类方法的结果差异。结果 Real-time PCR与LAMP单对通用引物能鉴定到属水平,此外, LAMP测定沙门氏菌时会有假阴性的情况出现;VITEK2生化鉴定能将少数沙门菌株鉴定到种的水平;质谱方法能鉴定到亚种水平,同时会出现鉴定不准确的情况。结论基于沙门氏菌属水平上, 4类方法都能快速准确鉴定沙门氏菌,但在使用快速检测技术时均应考量该方法的优点对实际工作的帮助以及缺点对检验结果的影响,才能提高检测效率。     

副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS检测方法的建立与应用

目的:建立快速检测副溶血性弧菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测方法。方法:考察培养基、培养时间、培养温度以及样品前处理方法对图谱质量和鉴定结果的影响,对方法的稳定性、重复性进行研究;采集461株副溶血性弧菌食品分离株MALDI-TOF-MS指纹图谱,并对图谱进行分析。结果:采用2%NaCl-TSA培养基,在37℃,24 h条件下培养,可达到强峰值信号,谱图重现性良好,甲酸-乙腈提取法获得的质谱图特征峰多,信噪比高;461株副溶血性弧菌食品分离株有97.6%的菌株鉴定分值大于2.000。结论:本研究建立的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS鉴定方法结果准确,可用于实际检测。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法检测副溶血性弧菌

目的 建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)检测副溶血性弧菌的方法。方法 从样品预处理方法、分析菌量、培养基、培养时间方面分析各因素对MALDI-TOF-MS方法重复性、鉴定结果准确性的影响。将从市售420份水产品中分离并用全自动微生物鉴定及药敏分析系统生化鉴定为副溶血性弧菌的123株菌株,用MALDI-TOF-MS对其进行鉴定,对比2种方法的鉴定结果。结果 采用混合溶液法进行预处理,3%NaCl营养琼脂培养基, 36℃培养24 h,分析菌量为8 mg,用MALDI-TOF-MS进行分析所得到的特征峰多、峰型稳定、杂峰少,质谱图的准确性和重复性高、与生化鉴定匹配性好。分离得到的123株副溶血性弧菌鉴定分值大于2.000的达98.4%。结论 MALDI-TOF-MS作为一种快速、准确、高效的检测方法,可用于食品中副溶血性弧菌快速检测。     

双启动寡核苷酸聚合酶链式反应法检测食品中的沙门氏菌

目的建立检测食品中沙门氏菌的双启动寡核苷酸-聚合酶链式反应(dual priming oligonucleotide-polymerase chain reaction,DPO-PCR)方法。方法以沙门氏菌invA基因为靶基因设计一对DPO引物,优化条件,对180份熟肉样本同时进行DPO-PCR和细菌分离鉴定。结果 DPO-PCR方法退火温度在52、57、62℃均可对靶基因高效扩增。方法特异性好,仅对沙门氏菌为阳性结果,而对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、β溶血性链球菌、铜绿假单孢菌无交叉反应。方法灵敏度可达4.3×10~2 CFU/mL。与细菌分离鉴定相比,两者检测结果完全一致。结论该方法快速、精准,可作为食品中沙门氏菌的快速检测方法。     

一例沙门氏菌测量审核的回顾与分析

目的通过测量审核提升本实验室检测沙门氏菌能力与自身竞争力。方法以测量审核作业指导书、出入境检验检疫行业标准SN/T1869-2007食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法和国家标准GB4789.4-2016食品微生物学检验沙门氏菌检验为依据,采用PCR方法和传统增菌、分离、生化反应、血清学法鉴定沙门氏菌。结果编号091样品检出沙门氏菌,编号123样品PCR检测出现假阳性,经生化鉴定证实检出非沙门氏菌。结论 PCR出现假阳性,需经生化鉴定予以确认。本次测量审核样本检测结果与制样单位反馈结果一致。     

禽肉中铜绿假单胞菌的分离及其耐药性

采用GB 4789.4—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中的选择性前增菌方法从鲜鹅肉、鸭肉样本中检测到2株疑似沙门氏菌的菌株,但经ATB生化鉴定和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)鉴定为铜绿假单胞菌。比对2株铜绿假单胞菌和沙门氏菌的生化图谱,其中鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶和L-阿拉伯糖的实验结果同为阳性,其余生化反应结果差异较大;2株铜绿假单胞菌的质谱标识峰足迹与肠炎沙门氏菌CICC21482有明显不同。微生物耐药实验结果表明:大部分抗生素对铜绿假单胞菌无抑制作用,只有喹诺酮类抗生素环丙沙星、氨基糖苷类抗生素庆大霉素和链霉素对其有一定的抑制作用。     

实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌

目的 建立实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。方法 基于鼠伤寒沙门氏菌II型限制酶基因, 设计引物及Taqman探针, 利用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果 特异性探针可从25种血清型沙门氏菌(共49株)及11株阴性对照菌株中检测出全部的11株鼠伤寒沙门氏菌。以鼠伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验, 菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系, 线性系数(R2)为0.998, 扩增效率90%, 最低检测浓度300 cfu/mL。对已接种鼠伤寒沙门氏菌的4种模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定, 两者结果一致。结论 此方法特异、灵敏、准确, 适于食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。     

3种方法鉴定鸡肉粉中沙门氏菌的比对研究

目的采用3种方法对鸡肉粉中沙门氏菌进行检测。方法3份样品的前处理依据组织方提供的《作业指导书》进行,每瓶样品直接加入4.5 mL灭菌去离子水复溶,作为初始样本,后续实验依据GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》操作。鉴定分离出疑似菌后,加入了实时荧光定量PCR法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法2种方法作为辅助检测,并用全自动微生物鉴定系统进行生化鉴定,再结合生化鉴定与血清学实验综合评判检测结果。结果使用3种鉴定方法在JS015、JS110、JS140样本中均检出沙门氏菌。结论本研究采用的实时荧光定量PCR法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法2种方法均能快速准确鉴定出沙门菌,特别是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法和血清学分型配合使用,对沙门菌的快速鉴定有重要意义。     

MALDI-TOF-MS鉴定2008年辽宁省食源性疾病监测系统检出的沙门菌的初步研究

目的应用MALDI-TOF-MS技术对2008年辽宁省食源性疾病监测检出的24株沙门菌和2株沙门菌标准菌株进行鉴定,并对其中4种血清型的16株沙门菌进行种水平的鉴定。通过MALDI-TOF-MS的相关性分析,研究MALDI-TOF-MS与血清分型结果的相关性及MALDI-TOF-MS对实验的沙门菌的分型能力。方法考察并确定既适合菌株生长又适宜MALDI-TOF-MS分析的沙门菌培养基后,应用MALDI-TOF-MS的相关软件对沙门菌进行数据采集和图谱比对,所得鉴定结果与血清分型结果进行比较。对属于4个种的4株沙门菌的蛋白峰信息进行比较分析。通过生化鉴定及MALDI-TOF-MS的聚类分析及主成分分析讨论4株肠炎沙门菌同源关系。结果 MALDI-TOF-MS技术分别在属和种的水平上准确鉴定了沙门菌株,并且在种的鉴定水平上与血清分型结果具有极大相关性。MALDI-TOF-MS区分了属于4个种的4株沙门菌的蛋白峰之间的微小差异。而且,对相同血清型的4株肠炎沙门菌的聚类分析及主成分分析显示出其同源程度的差异。结论 MALDI-TOF-MS技术在属水平上鉴定沙门菌具有很高的准确性,在种水平上的鉴定也有着很好的应用前景。...     

3种方法检测食品中致泻大肠埃希氏菌检测能力验证结果分析

目的提高食品中致泻大肠埃希氏菌的检测能力,促进实验室检测能力的提高。方法参照GB4789.6-2016《食品微生物学致泻大肠埃希氏菌检验》方法进行检测,采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统进行生化鉴定、血清学鉴定,对可疑菌落进行普通PCR确证试验。同时使用多重实时荧光PCR法以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionizationtime-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析鉴定可疑菌落。结果国标法和多重实时荧光PCR法能准确鉴定出目标菌,MALDI-TOF-MS可以检测大肠埃希氏菌,但无法区分致泻大肠埃希氏菌和肠出血性大肠埃希氏菌。结论 3种方法各有优劣,同时使用,综合判断,能确保试验结果准确快速。     

沙门氏菌MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱分析方法的研究

以沙门氏菌标准菌株(Salmonella enterica DSM 17058 T)为研究对象,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对其进行蛋白质指纹图谱分析,进而得到正确的鉴定结果。为了获得重现性良好的质谱图,对沙门氏菌的最佳培养基、最适培养时间以及样品前处理方法进行了优化,从而确立沙门氏菌MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱标准分析方法。结果表明:乙醇/甲酸处理法所得图谱中的特征峰多,包含更多的蛋白标志物,所得图谱基线平滑,噪音少,信噪比高,是最佳的样品处理方法。以营养丰富的哥伦比亚琼脂为培养基,在24 h时即可达到强峰值信号,质谱图重现性良好,鉴定结果准确,并且相比于其它3种培养基所需培养时间短。     

PNT—PCR检测食品中沙门氏菌方法的建立及应用

本文将自行研制的一种沙门氏菌强选择性增菌液PNT与PCR技术相结合,建立了快速、特异、敏感地检测食品中沙门氏菌的PNT—PCR技术。通过对食品样品、污水样品的检测,结果表明该检测系统可检出食品中10cfu的沙门氏菌。应用本检测系统检测各类食品及污水样品612份,PNT—PCR法检出沙门氏菌198份,而常规方法检出104份,本法在特异性、敏感性及实际样品检出率方面均显示了很强的优越性。     

奶粉样品中沙门氏菌能力验证结果与分析

目的验证分析实验室对奶粉样品中沙门氏菌检测能力。方法依据GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》、SN/T 1059.7-2010《进出口食品中沙门氏菌检测方法实时荧光PCR法》进行改进,参照能力验证计划参试指导书来进行测定和结果判断。结果通过荧光定量PCR法进行快速初筛,初步判断样品含有阳性沙门氏菌;传统平板法结合生化鉴定套装和VITEK2进行复筛,将可疑沙门氏菌进行血清分型,检出2种血清型O:4,12 H:i,2和O:9,12 H:m,g:-,分别为鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌;同时采用Ribo Printer全自动微生物基因指纹鉴定系统对可疑单菌落进行确证性鉴定,结果与血清分型一致。结论本次实验室的奶粉样品中沙门氏菌检测能力验证结果合格。     

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌三种鉴定方法的比较

以食品及环境样品中初步分离的13株疑似唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）为研究对象,通过比较生理生化检 测法、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）法和recA序列分析法,得到快速准确鉴定唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的方 法。 结果表明,13株疑似菌株经MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,而VITEK 2 COMPACT生理生 化法鉴定8株（62%）为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,其他5株为栖稻假单胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）。 在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的鉴 定方法中,MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法鉴定结果一致且准确,而VITEK 2 COMPACT生化检测法存在缺陷。 相比传统生理 生化鉴定方法,MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌鉴定中更为快速、准确。