泛素特异性肽酶22诱导胰腺癌细胞对吉西他滨耐药的观察

目的: 探讨泛素特异性肽酶22（ ubiquitin specific peptidase 22,USP22）在胰腺癌吉西他滨耐药中的作用。方法: 采用Western blot检测吉西他滨诱导不同胰腺癌细胞株对USP22表达情况的影响。利用胰腺癌SW1990亲本细胞株,构建吉西他滨耐药细胞株SW1990/Gem及USP22 siRNA稳定表达细胞株(表示为SW1990-shUSP22、SW1990/Gem-shUSP22);采用CCK-8实验检测抑制USP22表达对胰腺癌细胞吉西他滨敏感性的影响。结果: 1 μmol/L或10 μmol/吉西他滨诱导人胰腺癌PANC-1和SW1990细胞后,USP22表达均增高（P<0.05或P<0.01）。耐药细胞株SW1990/Gem中USP22蛋白表达显著高于SW1990亲本细胞株（P<0.01）。USP22 siRNA稳定表达细胞株SW1990-shUSP22,SW1990/Gem-shUSP22中USP22蛋白表达水平与相应对照组SW1990-NC,SW1990/Gem-NC相比,分别显著下调约65%（P<0.01）和60%（P<0.01）。SW1990-NC组和SW1990-shUSP22组对吉西他滨的IC50分别为（1 850.96±87.37） nmol/L和（534.83±49.68） nmol/L,差异具有统计学意义(P<0.01)。SW1990/Gem-shUSP22组对吉西他滨的IC50为（2 157.08±120.32） nmol/L,与SW1990/Gem-NC组（29 850.96±345.78） nmol/L相比,差异具有统计学意义(P<0.01);与SW1990-NC组（1 387.58±96.56） nmol/L相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论: 吉西他滨可诱导胰腺癌细胞USP22表达增高。抑制USP22表达可增加胰腺癌细胞对吉西他滨的药物敏感性,并可有效逆转胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药。本研究揭示胰腺癌细胞对吉西他滨耐药的新机制,为改善胰腺癌个体化化疗方案提供新思路。     

长链非编码RNA FOXN3-AS2在肝癌中的表达及其对肝癌细胞增殖和侵袭的影响

目的: 观察FOXN3-AS2基因在肝癌组织和细胞中的表达,探讨其对肝癌细胞增殖和侵袭的影响。方法: 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测肝癌组织和细胞株中FOXN3-AS2的表达水平。在表达水平最低的肝癌细胞株转染携带FOXN3-AS2的质粒以升高FOXN3-AS2的表达,细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和Transwell侵袭实验检测FOXN3-AS2高表达对肝癌细胞增殖活性和侵袭能力的影响。生物信息学预测FOXN3-AS2互补结合的miRNA及相关基因,qRT-PCR检测miRNA和相关基因mRNA的表达水平,Western blot检测相关蛋白的表达水平。结果: FOXN3-AS2在肝癌组织的表达水平显著低于癌旁组织（P<0.01）,在肝癌细胞株的表达水平显著低于人正常肝细胞（P<0.05）,在HepG2细胞的表达水平最低（P<0.01）。FOXN3-AS2高表达可显著抑制肝癌细胞的增殖活性（P<0.05）和侵袭能力（P<0.05）。FOXN3-AS2可互补结合miR-34a-5p,miR-34a-5p可互补结合Kruppel样因子4（KLF4）基因。FOXN3-AS2高表达可降低miR-34a-5p的表达水平（P<0.01）,KLF4 mRNA表达水平升高（P<0.01）,KLF4、β-catenin和E-cadherin蛋白表达升高,CDK4和Cyclin D1蛋白表达降低。结论: FOXN3-AS2在肝癌组织和细胞中表达降低,FOXN3-AS2高表达可抑制肝癌HepG2细胞的增殖和侵袭,其机制可能是调控miR-34a-5p及KLF4基因的表达。     

lncRNA PCAT19吸附miR-142-5p调控ING3基因表达抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭

目的：检测长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）PCAT19在鼻咽癌组织和细胞株中的表达量,探讨其抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭的分子作用机制。方法：实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测鼻咽癌组织和5种鼻咽癌细胞株中PCAT19的相对表达。在表达最低的鼻咽癌细胞株转染空载质粒（对照组）或高表达PCAT19质粒（实验组）。qRT-PCR检测转染效率。MTS法和Transwell侵袭实验分别检测高表达PCAT19对鼻咽癌细胞增殖能力和侵袭能力的影响。生物信息学预测PCAT19的靶基因。qRT-PCR和Western blot检测靶基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果：与慢性鼻咽炎组织比较,PCAT19在鼻咽癌组织的表达降低（P<0.01）。与永生化鼻咽上皮细胞比较,5种鼻咽癌细胞株PCAT19的表达均明显降低（P<0.05）,SUNE-1细胞中的表达最低（P<0.01）。转染高表达PCAT19质粒可明显促进PCAT19的表达（P<0.01）。高表达PCAT19可抑制鼻咽癌SUNE-1细胞的增殖能力（P<0.01）和侵袭能力（P<0.01）。PCAT19的靶基因是miR-142-5p,miR-142-5p的靶基因生长抑制因子3（inhibitor of growth gene 3, ING3）。高表达PCAT19后,miR-142-5p表达明显降低（P<0.01）,而ING3在mRNA和蛋白水平上的表达均明显增加（P<0.01）。 结论：鼻咽癌组织和细胞株中PCAT19的表达下调。上调PCAT19可抑制鼻咽癌SUNE-1细胞的增殖和侵袭能力,其作用机制可能是PCAT19通过吸附miR-142-5p促进ING3基因的表达。     

小分子干扰RNA抑制HLX1表达对急性髓系白血病细胞侵袭的影响及机制探讨

目的: 探讨小分子干扰RNA（siRNA）抑制人同源异型盒基因（H2.0-like homeobox,HLX1）表达对急性髓系白血病细胞系U937细胞增殖与侵袭能力的影响。方法: 利用HLX1特异的siRNA瞬时转染U937细胞,通过实时定量（RT-PCR）与蛋白印迹法（Western blot）分别测定HLX1的mRNA及蛋白质的表达水平,应用细胞体外增殖实验法（MTT）与体外侵袭实验观察siRNA抑制HLX1表达后的U937细胞增殖与侵袭变化。 结果: 相对于空白对照组,HLX1特异的siRNA转染24 h后可抑制U937细胞HLX1 mRNA表达,抑制率为（70.0±2.7）%（P<0.01）;转染48 h后可有效抑制HLX1蛋白质表达,抑制率为（81.0±3.1）%（P<0.01）;转染组U937细胞增殖能力显著下降（P<0.01）,转染组穿过基质胶的U937细胞数（22.0±2.3）显著低于空白对照组（66.0±5.0）(P<0.01), p-21活化激酶1（PAK1）蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。结论: siRNA下调HLX1表达水平可显著抑制急性髓系白血病细胞的增殖与侵袭能力。     

circZNF124通过靶向miR-4262调控结直肠癌SW620细胞增殖、迁移及侵袭的机制研究

目的：探讨circZNF124对结直肠癌SW620细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其机制。方法：体外培养人结直肠癌细胞SW620,随机分组：si-NC组、si-circZNF124组、miR-NC组、miR-4262组、si-circZNF124+anti-miR-NC组、si-circZNF124+anti-miR-4262组;CCK-8法、平板克隆形成实验、划痕实验与Transwell实验分别检测SW620细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭;双荧光素酶报告实验分析circZNF124与miR-4262的靶向结合;Western blot检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达量。结果：与si-NC组比较,si-circZNF124组细胞活力、划痕愈合率和N-cadherin蛋白水平降低（P<0.05）,细胞克隆形成数和侵袭细胞数减少（P<0.05）,E-cadherin蛋白水平升高（P<0.05）;circZNF124可负向调控miR-4262的表达;与miR-NC组比较,miR-4262组细胞活力、划痕愈合率和N-cadherin蛋白水平降低（P<0.05）,细胞克隆形成数和侵袭细胞数减少（P<0.05）,E-cadherin蛋白水平升高（P<0.05）;抑制miR-4262表达逆转了干扰circZNF124表达对SW620细胞增殖、迁移侵袭的作用。 结论：干扰circZNF124表达通过靶向miR-4262,减弱结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。     

结肠癌患者血清中miR-186-5p表达的研究

目的：探讨miR-186-5p在结肠癌中的表达及其对于结肠癌的影响,为结肠癌的治疗和预后治疗提供新的治疗靶点。方法：收集本院符合条件的病人血清样本,分为健康组、临床I、II、III、IV期5个组别（n=20）,利用miRVana microRNA分离试剂盒提取病人血清中的miRNA,利用荧光实时定量PCR检测miR-186-5p在不同阶段结肠癌病人血清中表达的差异。将miR-186-5p的全长基因克隆到pENTR/D-Topo载体,构建miR-186-5p高表达的细胞系,利用miR-186-5p抑制剂,降低miR-186-5p表达。利用细胞增殖ELISA试剂盒,将5×103/孔的细胞接种到96孔板中,孵育24 h后加入BrdU标记24 h,在370和492 nm测定吸光度,测定miR-186-5p对肿瘤细胞增殖的影响。用MTT法检测miR-186-5p对结肠癌细胞系对化疗药物敏感性的影响。结果：结肠癌病人血清中miR-186-5p呈低表达状态,与正常组相比,临床I、II、III、IV期病人血清中miR-186-5p表达明显减少（P<0.01）。利用质粒构建miR-186-5p高表达的细胞系,利用miR-186-5p抑制剂（hsa-miR-186-5p inhibitor）降低SW480、HCT116两种细胞内miR-186-5p的表达。与对照组相比,过表达miR-186-5p的HCT116细胞和SW480细胞增殖能力减弱,说明miR-186-5p表达增多抑制了HCT116细胞和SW480细胞的增殖。miR-186-5p抑制剂处理后,与对照组相比,HCT116细胞和SW480细胞的增殖能力均升高,说明miR-186-5p表达降低可以增加HCT116细胞和SW480细胞的增殖。不同浓度顺铂处理24 h后,高表达miR-186-5p的HCT116和SW480细胞死亡率均高于对照组（P<0.01）,miR-186-5p表达降低后,死亡率低于对照组（P<0.01）。在miR-186-5p高表达的结肠癌细胞系中,PLK1蛋白表达降低,而抑制miR-186-5p表达后,PLK1蛋白表达升高。 结论：结肠癌患者中miR-186-5p表达降低,过表达miR-186-5p可以抑制结肠癌细胞增殖生长,并降低结肠癌细胞的耐药性,抑制miR-186-5p表达可以增加结肠癌细胞增殖,并增强细胞的耐药性。     

miR-34a通过调控雄激素受体基因抑制前列腺癌细胞系LNCaP增殖

目的：探究miR-34a对雄激素受体（AR）基因的调控作用及对前列腺癌（PCa）LNCaP细胞增殖、凋亡的影响。方法：收集2016年10月至2019年9月本院泌尿外科行前列腺穿刺活检确诊为PCa患者组织标本36例,另取同期行手术治疗切除的良性前列腺增生（BPH）组织标本41例。体外培养LNCaP细胞,分别转染miR-34a mimics（mimics组）,miR-34a mimic NC（NC组）,设正常生长细胞为空白对照组（BC组）,另在mimics组基础上转染AR过表达（AR过表达组）载体及其对照（AR对照组）,采用CCK-8试剂盒检测细胞活性,Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率,实时定量PCR（RT-qPCR）检测miR-34a及AR mRNA表达水平,免疫印迹法检测AR蛋白、细胞周期蛋白D1（cyclinD1）及原癌基因产物（c-Mcy）、细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、capase-3）的表达水平。结果：与BPH组织比较,PCa组织中miR-34a表达水平显著降低（P<0.05）,AR mRNA及蛋白表达水平均显著增加（P<0.05）;与BC、NC组比较,mimics组LNCap细胞miR-34a表达水平、细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著增加（P<0.05）,AR、Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,同一时间LNCap细胞活力均显著降低（P<0.05）;双荧光素酶实验结果显示,miR-34a与AR可能存在一定的调控关系,过表达AR基因可逆转miR-34a mimics对LNCaP细胞增殖抑制,促进凋亡作用。 结论：miR-34a可能通过调控AR抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖,促进其凋亡。     

miR-200a对肾小管上皮细胞转分化的调控作用

目的: 探讨miR-200a对TGF-β₁诱导的肾小管上皮细胞间质转分化的影响。 方法: 体外培养肾小管上皮细胞（HK-2）,TGF-β₁(终浓度为10 ng/mL)作用12、24、48 h,采用qPCR检测miR-200a的表达,qPCR和Western Blot检测上皮转分化相关蛋白E-cadherin和ɑ-SMA的mRNA和蛋白表达;用agomir和antagomir分别转染细胞,其中转染agomir后用TGF-β₁诱导肾小管上皮细胞,qPCR、Western Blot和细胞免疫荧光检测E-cadherin和ɑ-SMA的mRNA和蛋白表达情况。 结果: 在TGF-β₁诱导下miR-200a的表达随着时间逐渐降低（P<0.05）,E-cadherin表达呈降低趋势（P<0.05）,ɑ-SMA表达逐步上调（P<0.05）;agomir使miR-200a表达明显升高（P<0.05）,antagomir使miR-200a表达降低（P<0.05）;与转染NC-miRNA相比,agomir在mRNA和蛋白水平上调E-cadherin的表达（P<0.05）,下调ɑ-SMA的表达（P<0.05）;antagomir则抑制E-cadherin的表达（P<0.05）,增加ɑ-SMA的表达（P<0.05）,细胞免疫荧光表达情况与蛋白水平相符。 结论: miR-200a能减弱TGF-β₁诱导的肾小管上皮细胞转分化。     

下调lncRNA LINC00176对肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药和自噬的影响

目的：研究下调lncRNA LINC00176对肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药和自噬的影响及机制。方法：qRT-PCR方法测定正常支气管上皮16HBE细胞和肺癌A549、A549/DDP、NCI-H1299、SK-MES-1细胞中LINC00176的表达。将A549/DDP细胞分成对照组、si-NC组、si-LINC00176组、si-LINC00176+Anti-miR-NC组、si-LINC00176+Anti-miR-138-5p组。MTT实验检测顺铂对A549/DDP的半数抑制浓度（IC50）。流式细胞术测定细胞凋亡。Western blot测定LC3-I、LC3-II、Beclin 1、C-Caspase-3蛋白表达。利用荧光素酶报告系统鉴定LINC00176和miR-138-5p的靶向关系。结果：与16HBE细胞比较，A549、A549/DDP、NCI-H1299、SK-MES-1细胞中LINC00176表达水平显著升高（P<0.01）。与A549细胞比较，A549/DDP细胞中LINC00176表达水平显著升高（P<0.01）。与对照组、si-NC组比较，si-LINC00176组A549/DDP细胞IC50显著降低（P<0.01），LC3-II/LC3-I、Beclin 1蛋白表达显著降低（P<0.01），凋亡率、C-Caspase-3蛋白表达、miR-138-5p表达水平显著升高（P<0.01）。LINC00176与miR-138-5p直接结合。与si-LINC00176+Anti-miR-NC组比较，si-LINC00176+Anti-miR-138-5p组A549/DDP细胞IC50显著升高（P<0.01），LC3-II/LC3-I、Beclin 1蛋白表达显著升高（P<0.01），凋亡率、C-Caspase-3蛋白表达显著降低（P<0.01）。 结论：下调lncRNA LINC00176通过靶向上调miR-138-5p能够抑制肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药，抑制细胞自噬，诱导细胞凋亡。     

miR-222、MBD2在胃癌患者中的表达及对铂类化疗敏感性的影响

目的:研究miRNA-222与甲基化CpG结合结构蛋白2（MBD2）水平在胃癌组织中的表达水平及其对铂类化疗敏感性的影响。方法:选择2016年2月至2017年5月在本院就诊的75例原发性胃癌患者作为研究对象。检测患者癌组织及癌旁组织中miR-222、MBD2表达水平；分析miR-222、MBD2水平与胃癌临床病理参数的相关性。将miR-222 inhibitor转染至胃癌SGC-7901细胞中，RT-PCR和Western blot分别检测转染后细胞中miR-222和MBD2的表达水平，MTT法、流式细胞术分别检测转染对细胞增殖、凋亡的影响。结果:胃癌组织中miR-222的阳性表达率显著高于癌旁组织（P<0.05）。胃癌组织中miR-222相对表达量显著高于癌旁组织（P<0.05）。胃癌组织中MBD2的阳性表达率显著低于癌旁组织（P<0.05）。miR-222及MBD2表达水平与分化程度、TNM分期有明显相关性（P<0.05）。转染miR-222 inhibitor的各组SGC-7901细胞中miR-222表达水平均显著低于空白对照组（Control组）和miR-NC组（NC组）（P<0.05）。转染miR-222 inhibitor的各组细胞中MBD2 mRNA和蛋白表达水平显著高于Control组和NC组（P<0.05）。转染miR-222 inhibitor的各组细胞的增殖率显著低于Control组和NC组（P<0.05），且miR-222 inhibitor+顺铂（Cisplatin，CDDP ）组的细胞增殖率显著低于miR-222 inhibitor组及CDDP 组，细胞凋亡率显著高于miR-222 inhibitor组及CDDP 组（P<0.05），且与CDDP联合运用能够更明显地抑制肿瘤细胞的增殖率，促进细胞的凋亡。结论:miR-222在胃癌组织中表达明显上调，MBD2显著下调，其表达高低与胃癌分化程度、TNM分期有明显相关性。miR-222可增强 CDDP 对胃癌的化疗敏感性，其可能通过抑制胃癌中的靶基因MBD2发挥作用。     

胰岛素受体底物1低表达促进头颈部鳞状细胞癌的侵袭转移

目的: 研究胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1, IRS-1)在头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)侵袭转移中的作用及其可能的机制。 方法: 应用定量RT-PCR法检测HNSCC患者淋巴结转移灶和原发灶癌组织中IRS-1 mRNA的表达,以及不同转移能力头颈部肿瘤细胞株上IRS-1 mRNA的表达。用Taqman探针法检测miR-9及U6的相对表达量。利用小干扰RNA技术阻抑IRS-1表达,肿瘤细胞侵袭实验检测IRS-1干扰前后对细胞侵袭能力的影响。用定量RT-PCR和Western blot检测上皮-间叶转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的标志物E-cadherin及vimentin mRNA和蛋白的表达;用SRB法检测细胞存活率。 结果: (1)HNSCC患者淋巴结转移灶中IRS-1 mRNA的表达低于原发灶(P<0.05);高转移性HNSCC细胞株中IRS-1 mRNA的表达低于低转移性细胞株(P<0.05)。(2)下调IRS-1表达,肿瘤细胞的侵袭能力增强,上皮-间叶转化标志物E-cadherin表达下降,同时伴有miR-9表达的升高。 结论: IRS-1低表达可能通过上皮-间叶转化和上调miR-9而增强细胞的侵袭能力,促进HNSCC的转移。     

内质网相关降解蛋白Derlin-1通过抑制ERK信号通路抗人结肠癌细胞增殖

目的: 探讨内质网相关降解蛋白Derlin-1对人结肠癌SW480细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法: 采用sh-Derlin-1-pGPU6/Neo质粒转染构建瞬时敲除Derlin-1基因的SW480细胞株，应用实时定量PCR和免疫印迹验证Derlin-1基因和蛋白的低表达，采用CCK8法检测SW480细胞增殖情况，流式细胞仪检测SW480细胞凋亡情况，Western blot检测SW480细胞中凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达量和ERK磷酸化水平。结果: 使用pGPU6/Neo载体能够稳定地抑制SW480细胞中Derlin-1的表达，sh-Derlin-1组细胞增殖率相对于对照组显著降低、凋亡率显著升高（P<0.05），Western blot实验结果发现sh-Derlin-1组细胞中Bcl-2表达量显著降低、Bax表达量显著升高及ERK磷酸化水平显著降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论: Derlin-1表达的降低能抑制ERK信号通路活化，进而诱导人结肠癌SW480细胞凋亡、抑制增殖。     

miR-106 b在乳腺癌组织中的表达及其增强乳腺癌细胞顺铂化疗敏感性的机制研究

目的:探讨miR-106 b在乳腺癌组织中的表达及其增强乳腺癌细胞顺铂化疗敏感性的机制。方法:随机选取2015年10月至2018年5月在本院进行手术切除的乳腺癌患者58例,取乳腺癌组织和癌旁组织提取细胞DNA,用荧光定量PCR的方法检测miR-106 b的表达量。购买乳腺癌MCF-7细胞系,构建促进miR-106 b表达的高表达组、抑制miR-106 b表达的低表达组细胞系。用不同浓度的顺铂处理,48 h后观察在体外和裸鼠皮下肿瘤的受抑制情况。荧光定量PCR法检测PTEN/PI3K/AKT信号通路相关基因的表达。结果:荧光定量PCR显示乳腺癌组织中miR-106 b的相对表达量高于癌旁组织（P<0.05）。在20、30和40 μmol/L浓度时,对照组和高表达组的相应浓度下的细胞抑制率均显著高于低表达组,对照组相应浓度下的细胞抑制率均显著高于低表达组（P<0.05）。在20、30和40 μmol/L浓度时,对照组和高表达组的相应浓度下的荧光强度均低于低表达组,且高表达组均显著低于对照组（P<0.05）。低表达组PTEN的相对表达量显著低于对照组,而高表达组PTEN的相对表达量显著高于对照组（P<0.05）。低表达组的PI3K和AKT的相对表达量显著高于对照组,高表达组的PI3K和AKT的相对表达量显著低于对照组（P<0.05）。结论:miR-106 b在乳腺癌中高表达,且表达量越高,乳腺癌细胞对顺铂的化疗敏感性越强。     

CD40调节胰腺癌细胞生物学行为的研究

目的: 研究CD40L对胰腺癌细胞生物学特性、干性的影响。方法: CCK-8活细胞计数法分析CD40可溶性配体（sCD40L）不同浓度（0、1、2、4 μg/mL）在不同时间对人胰腺癌细胞系panc02生长增殖的影响,AnnexinV/PI双染法检测凋亡;细胞划痕实验检测迁移的改变。Q-PCR检测4 μg/mL sCD40L处理panc02 48 h后c-Myc、OCT-4、Sox-2水平的改变。建立Balb/c裸鼠胰腺癌荷瘤模型,随机分为2组,对照组（生理盐水）和sCD40L（10 mg/kg）组,分别腹腔注射sCD40L 10 mg/kg以及等体积生理盐水,每天注射3次,游标卡尺测量0、7、14、21、28 d时肿瘤体积。结果: 与对照组比较,浓度为1、2、4 μg/mL的sCD40L处理panc02 96 h时可显著抑制panc02的增殖（P＜0.01）,并促进panc02的凋亡（P＜0.01）,并呈剂量依赖性地抑制panc02的迁移能力（P＜0.01）;sCD40L 4 μg/mL组可明显抑制panc02细胞的c-Myc、OCT-4、Sox-2的表达（P＜0.01）。在裸鼠荷瘤实验中,与对照组比较,sCD40L处理28 d明显抑制肿瘤体积（P＜0.01,252±13 vs. 189±9）。结论: CD40通路的活化能够抑制胰腺癌细胞增殖迁移、促进凋亡,同时抑制胰腺癌细胞系体内的增殖能力,而这一效应可能与CD40L抑制胰腺癌细胞系干性相关。