人源蛋白激酶B的原核表达研究

确定人源PKB在大肠杆菌中的表达条件.方法构建PKB原核表达质粒pET-28-PKB,转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,通过改变诱导剂IPTG浓度、诱导时间、诱导温度和菌体浓度确定了PKB的最佳表达条件,并初步纯化PKB蛋白.结果确定了重组菌株的最佳表达条件为:37℃、200 r/min培养2 h后,28℃、1 mmol/L IPTG诱导培养8 h.超声破碎菌体,经8M尿素变性、12 000 rpm/min离心和亲和层析,获得了纯化的PKB.结论为PKB蛋白的表达纯化建立了可行性的技术方案.     

乳酸脱氢酶A(ldha)基因的克隆与原核表达

乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶,在厌氧条件下能催化丙酮酸生成乳酸;当动物体内缺乏葡萄糖时,还可氧化乳酸生成丙酮酸并经葡萄糖异生途径转变为葡萄糖。通过反转录PCR获得了Hela细胞中的ldha基因,并将它克隆到pET28a(+)载体上,获得重组表达载体pET28a(+)-ldha。重组质粒通过转化法转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中。SDS-PAGE分析表明,在1.0 mmol·L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了一条分子质量约为36 kDa的目标蛋白。     

融合蛋白sCAR-TSP-1原核表达纯化及诱导白血病细胞K562凋亡的研究

根据thrombospondin-1(TSP-1)氨基酸序列(RFYVVMWK),以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸对应基因核苷酸通过PCR扩增于sCAR之后,得到sCAR-TSP-1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-TSP-1。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE分析表明,有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-TSP-1对白血病细胞K562有明显凋亡作用。     

人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的SAA1定量检测新方法.利用大肠杆菌BL21(DE3)原核表达人血清淀粉样蛋白A1(SAA1),根据BL21(DE3)表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段,构建表达载体pET-28a-SAA1,采用CaCl2法制备BL21(DE3)感受态,热激转化法将pET-28a-SAA1转入到BL21(DE3).经表达条件优化,获得重组蛋白最佳诱导表达条件:温度30℃,时间6h,转速180rpm/min,培养基pH 7.0,IPTG浓度0.4mM,诱导表达后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,Ni柱纯化、透析、浓缩从而获得浓度为8.09mg/ml,纯度为85%的SAA1.同时,结合胶体金标记技术,建立了SAA1胶体金免疫层析试纸检测方法,线性范围0.16~500μg/ml,最低检测限0.16μg/ml,该研究为临床体外诊断SAA1快速检测提供技术基础.     

HCV e2-3pcx融合基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

构建了丙型肝炎病毒e2-3pcx融合基因的原核表达载体pET28b(+)-e2-3pcx,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。IPTG诱导融合蛋白高效表达。经SDS-PAGE电泳分析,结果表明在43 ku处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致。     

融合蛋白sCAR—TSP-1原核表达纯化及诱导白血病细胞K562凋亡的研究

根据thrombospondin-1（TSP-1）氨基酸序列（RFYVVMWK）,以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸对应基因核苷酸通过PCR扩增于sCAR之后,得到sCAR—TSP-1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-TSP-1。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE分析表明,有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-TSP-1对白血病细胞K562有明显凋亡作用。     

猪白血病抑制因子(LIF)的原核表达

根据GenBank中猪LIFcDNA基因序列扩增出目的基因片断,并将扩增的片断克隆进pET-31b表达载体的Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间,经转化使其在大肠杆菌BL21中表达,产生重组猪LIF蛋白.结果表明,所构建的原核表达质粒PET-31b-mpLIF含有编码成熟型猪LIF蛋白的cDNA序列;表达结果显示,诱导样品在相对分子质量约20000的位置上有明显的增强表达条带.     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.     

马铃薯X病毒CP基因的原核表达及特异性抗血清的制备

依据马铃薯x病毒(Pottato virus X，PVX)外壳蛋白(CP)基因序列(711bP)设计合成了两对引物，通过RT—PCR扩增得到长0．7bp的目的片段．将目的片段转入大肠杆菌，酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子，测定序列结果与其他PVx分离物CP基因序列比较，发现其核苷酸同源性最高可达99％左右，证明此病毒为PVX．构建了含PVx CP基因的融合蛋白原核表达载体，并在大肠杆菌中得到表达，SDS—PAGE测定该融合蛋白GST—xCP的相对分子质量为52000．Westem blot分析结果显示，GST—XCP与PVX抗血清有很强的免疫反应，表明GST—XCP有天然状态下病毒核衣壳蛋白的抗原性、制备了GST—xCP抗血清，并利用此抗血清建立了PVx的间接ELISA检测方法，检测灵敏度为1mg鲜重的病株叶片．     

马铃薯X病毒CP基因的原核表达及特异性抗血清的制备

依据马铃薯X病毒(PotatovirusX,PVX)外壳蛋白(CP)基因序列(711bp)设计合成了两对引物,通过RT-PCR扩增得到长0.7bp的目的片段.将目的片段转入大肠杆菌,酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子,测定序列结果与其他PVX分离物CP基因序列比较,发现其核苷酸同源性最高可达99%左右,证明此病毒为PVX.构建了含PVXCP基因的融合蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中得到表达,SDS-PAGE测定该融合蛋白GST-XCP的相对分子质量为52000.Westemblot分析结果显示,GST-XCP与PVX抗血清有很强的免疫反应,表明GST-XCP有天然状态下病毒核衣壳蛋白的抗原性.制备了GST-XCP抗血清,并利用此抗血清建立了PVX的间接ELISA检测方法,检测灵敏度为1mg鲜重的病株叶片.     

果皮酵素的制备及抗氧化活性研究

本文研究以新鲜果皮为原料,采用市面常用菌种来发酵制备果皮酵素。为进一步优化果皮酵素的发酵工艺参数,以超氧化物歧化酶（SOD）活力为测定指标,通过正交试验确定果皮酵素的最优发酵条件。结果表明,糖浓度为25%,发酵时间为36h,接种量为6%,发酵温度为30℃时发酵效果最好。该条件下果皮酵素的超氧化物歧化酶（SOD）活力平均值为46.84U/ml。该研究为果皮酵素的制备和抗氧化活性研究奠定了基础。     

植酸酶产生菌株的酶活力研究

从土壤中分离、纯化出植酸酶产生菌株,对其中的青霉的曲霉进行酶活力的测定,结果曲霉的酶活力高于青霉,曲霉的产酶水平较高。     

胞内分枝杆菌HSP 70基因的克隆、分析及原核表达

胞内分枝杆菌为致病性非结核分枝杆菌（NTM）之一,分布广泛,人畜均可感染,对人畜健康造成极大威胁。应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HSP 70基因,利用在线分析软件对其进行生物信息学分析。构建原核表达载体p ET15b-HSP 70,同时进行诱导表达。结果显示,胞内分枝杆菌HSP 70基因完整,ORF基因全长1860bp,共编码619个氨基酸,HSP 70为酸性、亲水性蛋白质,不存在明显跨膜结构,含14个潜在磷酸化位点,亚细胞定位主要存在于细胞质中,无信号肽结构。二级结构预测,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。同时,以同源建模法预测了HSP 70基因编码蛋白的三维立体结构。成功构建p ET 15b-HSP 70原核表达载体,在原核表达系统中该载体可诱导表达70ku的HSP70重组蛋白。     

患病草鱼主要消化酶活性变化的研究

分析了健康鱼和患肠炎病草鱼的淀粉酶和蛋白酶活性。其淀粉酶最适pH值均为7．2，蛋白酶最适pH值分别为7．0和6．0；其淀粉酶最适温度分别为30℃和35℃，蛋白酶最适温度均为40℃，且患肠炎病草鱼蛋白酶和淀粉酶活性较健康鱼低，但pH值在5．7以下时，患病鱼的蛋白酶活性较健康鱼高；温度在28℃以下时，患病鱼的淀粉酶活性比健康鱼高。     

过量Mg^2＋对土壤中酶活性的影响

目的研究过量Mg^2＋对土壤中脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性的影响.方法通过在清洁土壤中投加不同质量浓度的MgC l2试剂,经过28 d的培养,期间在第1、3、7、14、28 d取样,测定土壤中的脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性.结果数据分析表明Mg^2＋对脲酶有激活作用,当Mg^2＋的质量分数为0.6%时,土壤脲酶活性提高最多,为91.6%,脲酶活性增加的程度为：0.6%〉0.8%〉0.4%〉0.2%〉1.0%〉0,并且第1 d是观测脲酶变化的最佳时间.Mg^2＋对磷酸酶活性有先激活再抑制的作用,其活性在第3 d有大幅度增加,而从第14 d开始到第28 d,5个含不同质量分数Mg^2＋的土样,其磷酸酶活性全都低于空白试验。过氧化氢酶活性在试验的所有土样中均受到长效抑制.结论脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶对Mg^2＋反映敏感,在Mg^2＋质量分数为0.6%时可以短期提高土壤肥力,但是长期大量的Mg^2＋介入土壤会严重影响土壤肥力,因此,可以考虑以Mg^2＋作为镁污染土壤的生态毒理指标.     

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.