层流剪切力对脐血CD34+细胞向各系分化的影响

为了研究层流剪切力对造血干细胞体外扩增及向各系造血祖细胞分化的影响,考察了在3组不同大小层流剪切力0、0.03、0.06 Pa的作用下,CD34+细胞为起始细胞的造血干/祖细胞体外扩增和向各系祖细胞分化的情况.结果表明:3组总细胞、CD34+细胞及CD34+38-细胞的扩增无显著性差异;0.03 Pa层流剪切力使造血干细胞更易于向红系祖细胞系分化;0.06 Pa层流剪切力使其更易于向粒-巨噬祖细胞系分化;无层流剪切力作用下造血干细胞更易于向混合系祖细胞系分化.     

融合蛋白EGFP-PPA原核表达及标记肿瘤细胞研究

肿瘤细胞糖基化改变是非常普遍的现象,与恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系。掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)是一种甘露糖特异性结合凝集素,与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein EGFP),通过基因工程技术形成融合基因,并在大肠杆菌中表达纯化了EGFP-PPA融合蛋白。实验结果表明,此融合蛋白可以识别实体肿瘤细胞表面的一部分标志,如Hep3B、Hu7、PLC、BEL-7404以及A549,而不能识别肝正常细胞L02,提示实体瘤细胞表面显露的甘露糖残基被此融合蛋白所识别,说明PPA识别具有甘露糖表型的实体瘤细胞表面的一部分,这些实验结果为进一步阐明甘露糖显露细胞在肿瘤发生发展中的作用提供了新的研究手段。     

肝癌细胞系Huh7中肿瘤干细胞分离及鉴定

利用肿瘤干细胞具有自我更新能力的特点,首次采用悬浮培养技术从Huh7细胞系中得到肝癌（干）细胞球,并通过RT-PCR、流式细胞术和免疫荧光等方法检测它们的干细胞标记和分化标记.结果显示Huh7（干）细胞球的干性相关基因表达上调;分化相关基因表达下调;流式细胞仪检测结果表明88.82％的Huh7（干）细胞球表达EpCAM基因,与正常Huh7细胞相比表达上调.表明该方法具有富集肝癌干细胞的效果,为以后肝癌干细胞建立更高效的分离方法提供了一种新的技术方法.     

采用高通量方法筛选用于人类胚胎干细胞体外长期培养的温敏型水凝胶

人类胚胎干细胞（hESC）的体外培养通常需要附着在蛋白质培养基质或饲养细胞层上,并主要依靠细胞的酶解离方法传代。采用动物来源的蛋白酶处理如此敏感的细胞会损伤膜蛋白、增加污染风险,这显然是不可取的,应尽量避免使用。在此,我们汇报了采用高通量方法筛选出一类以2-（二乙基氨基）乙基丙烯酸酯为主要单体的温敏型水凝胶。该类材料不仅具有在小幅度降温时改变性能以使其表面生长的干细胞脱粘附的功能,从而取代细胞传代中使用的生物酶,而且能取代蛋白质基质使hESC可以在体外进行长期培养（〉20代）,并保持完整的干细胞特征。这些具有可控化学结构的、可取代具动物来源生物基质的合成材料代表了一种新型的体系。它将是一种能使干细胞的培养达到可控、高效和安全的材料,会大大促进干细胞的深入研究和在临床医学中的应用。     

冻存复苏后骨髓间充质干细胞体外扩增和多向分化潜能研究

冻存复苏的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)被传至15代并分别诱导成软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞，以此研究冻存干细胞的扩增和分化潜能.结果表明，复苏细胞在软骨细胞诱导液的作用下分化为软骨细胞，对甲苯胺蓝异染并通过RT PCR检测出Ⅱ型前胶原mRNA的表达；在脂肪细胞诱导液的作用下，可检测到被诱导细胞中脂滴的产生，通过油红O染色显示出细胞核周围聚集的脂滴；在神经细胞诱导液的作用下，通过免疫组化和RT PCR均检测出被诱导细胞具有巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达，分化细胞延伸分支， 末端为典型曲张体.推断复苏的hMSCs仍是具有向软骨、脂肪和神经元多系分化的潜能性干细胞群，可以作为细胞组织工程和治疗相关疾病的一种干细胞来源.     

适宜不同种类细胞的温敏性共聚物膜的筛选

以温敏性聚N-异丙基丙烯酰胺(poly(N-isopropylacrylamide),PNIPAAm)为主体的细胞培养基底通过温度的改变来调控细胞在其上的黏附和脱附,有效替代传统酶解法实现贴壁细胞的非酶解收获,同时,贴壁细胞对温敏性基底具有选择性。选取贴壁型HeLa细胞、HEK293细胞、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)和脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)作为考察对象,采用具有不同表面润湿性、表面形貌和膜厚度等特征的系列PNIPAAm共聚物膜作为备选培养基底,考察查适合这四种细胞黏附和脱附的共聚物膜性能范围。实验结果表明,不同种类细胞对温敏性基底具有不同的选择性,同时为上述细胞分别选取了适宜的温敏性共聚物膜。     

自表达SIRPα-Fc融合蛋白对T细胞功能的影响

探讨携带SIRPα-Fc(SF)融合基因蛋白基因的重组腺病毒Ad35-SF感染T细胞后对T细胞功能的影响。腺病毒Ad35-SF感染Jurkat T细胞后,通过Western blotting及ELISA方法检测细胞上清中SF融合蛋白的大小与表达量;通过流式分析技术检测细胞表面CD47的封闭情况;通过CCK8方法检测细胞的增殖与对肿瘤细胞的杀伤作用。结果表明,Ad35-SF构建成功,其感染Jurkat T细胞后,能在其内表达并分泌产生大小约为48kD的SF蛋白,细胞上清中SF的表达量可到达19.1μg/mL。Ad35-SF(MOI=1)感染Jurkat细胞18h后,细胞CD47阳性比例从97.06%下降到15.32%;当Ad35-SF感染复数增加至5,10时,CD47阳性比率进一步降低至2.94%和1.73%。相对于空病毒对照组,Ad35-SF感染Jurkat细胞48h后其增殖效果提高了29%,对肝癌细胞株Hep 3B的杀伤作用提升25.6%(p0.01)。结果表明构建的重组腺病毒Ad35-SF能有效感染Jurkat细胞并在其内表达分泌SF蛋白,封闭细胞表面的CD47,同时显著提高Jurkat细胞的增殖能力和对肝癌细胞的杀伤作用。     

干细胞相关基因与肿瘤治疗

肿瘤干细胞同样具有自我更新,繁殖的能力,并能够表达特定的干细胞标记。目前仍然不清楚肿瘤干细胞是来源于普通干细胞的变异还是由肿瘤细胞再分化为干细胞样的细胞。常规的治疗方法能够杀死多数的肿瘤细胞,但极少量肿瘤干细胞的存在即可造成肿瘤的复发。该文对肿瘤干细胞,干细胞相关基因,肿瘤干细胞分离等的问题进行了综述,并提出了简单的评论及发展趋势预测,为肿瘤的基因研究及临床治疗提供参考。     

亚油酸和α-亚麻酸对脂肪干细胞活力及成脂分化的影响

应用MTT比色法检测不同浓度的亚油酸和α-亚麻酸对脂肪干细胞活力的影响,利用油红O染色法和甘油三酯质量摩尔浓度测定法检测亚油酸和α-亚麻酸对脂肪干细胞成脂分化的影响。MTT结果表明,在一定浓度范围内,α-亚麻酸能够显著增强细胞活力,但在较高浓度(60μmol/L)体现出明显的细胞毒性作用;而亚油酸能够显著抑制脂肪干细胞活力。油红O染色和甘油三酯测定结果表明,与对照组相比,亚油酸和α-亚麻酸均能促进脂肪干细胞成脂分化;与α-亚麻酸相比,亚油酸对脂肪干细胞成脂分化的促进作用更强,且呈现剂量依赖性。     

新生小鼠骨骼肌成肌细胞分离和分化方法研究

建立一个高效的分离和分化小鼠成肌细胞的方案,以便探讨MAML1在转基因小鼠中肌管的形成和肌肉发生中的作用。使用细胞分化方法鉴定MAML1在肌肉发生中的作用。使用Western blot检测肌肉发生的标志蛋白肌球蛋白Myosin的表达。研究发现,传代次数少于5次及卫星细胞对成肌细胞在体外形成正确的肌管非常重要。不传代直接进行诱导分化,能促使成肌细胞形成更多的肌管。在MAML1转基因小鼠中,MAML1通过促进形成更多、更粗壮而长的肌管,提高肌球蛋白的蛋白水平来促进肌肉发生。这些MAML1转基因的肌管能够持续存在超过5天,然后才会降解。     

Feasibility study of marrow stromal cells transplantation into guinea pig cochlea

Objective This pilot-study was designed to evaluate the feasibility of cell transplantation into guinea pig cochlea. Methods Marrow stromal cells were labeled with DAPI, and then implanted into the cochlea of guinea pig.The existence and differentiation trend were observed roughly two weeks later by histologic analysis. Results Transplant-derived marrow stem cells survived in cochlea two weeks later with a trend of attaching to cochlear architecture but not differentiate into neuron. Conclusions Transplant-derived marrow stem cells can survive in cochlea,and cell transplantation may be a useful strategy in inner ear diseases.     

Feasibility study of marrow stromal cells transplantation into guinea pig cochlea

Objective This pilot-study was designed to evaluate the feasibility of cell transplantation into guinea pig cochlea. Methods Marrow stromal cells were labeled with DAPI, and then implanted into the cochlea of guinea pig. The existence and differentiation trend were observed roughly two weeks later by histologic analysis. Results Transplant-derived marrow stem cells survived in cochlea two weeks later with a trend of attaching to cochlear architecture but not differentiate into neuron. Conclusions Transplant-derived marrow stem cells can survive in cochlea, and cell transplantation may be a useful strategy in inner ear diseases. Foundation item: Project (30000094) supported by the National Nature Science Foundation of China; project supported by the Postdoctoral Foundation of Central South University     

突变型P53特异性活化T细胞的诱导与扩增

采用多种细胞因子诱导外周血单核细胞分化为成熟的树突状细胞（DC,Dentritic Cell）,将成熟DC与初始T细胞共培养,并连续加入DC刺激从而避免活化的T细胞凋亡。将活化的T细胞转入包被有CD3和CD28抗体的板中,使活化T细胞进一步大量扩增。流式检测多因子诱导后DC表型发现,高表达CD83、CD11c、CD11b、CD80、CD86、CCR7、CD54,低表达CD14、CD3、CD33,说明因子成功诱导单核细胞为成熟DC。流式检测扩增的活化T细胞发现高表达CD3、CD8,含有很低量的调节性T细胞（Treg）,分泌大量的IFN-γ,表明扩增出的细胞中活化T的含量很高,为临床研究提供参考。     

TGF—β1对肝癌细胞系Hep3B中干性相关基因表达的影响

有研究表明TGF-β1可以诱导诸多上皮来源的癌细胞和正常细胞发生EMT并使其功能发生改变。实验就TGF-β1对肝癌细胞系Hep3B的作用展开研究：通过CCK8检测TGF-β1对Hep3B细胞增殖的影响,RT-PCR实验检测TGF-β1处理后细胞中EMT及干性相关基因的表达变化。结果表明：TGF-β1对Hep3B细胞的增殖无抑制作用;TGF-β1处理Hep3B细胞6d后EMT相关基因的mRNA表达水平并无显著改变,但TGF-β1可上调Hep3B细胞干性基因Oct-4,Klf-4,Nanog,C-myc的表达,并下调分化基因albumin的表达。结果提示TGF-β1一定程度上影响肝癌细胞系的干性基因表达,但并不一定是以发生EMT为前提的。     

TGF-β1对肝癌细胞系Hep3B中干性相关基因表达的影响

有研究表明TGF-β1可以诱导诸多上皮来源的癌细胞和正常细胞发生EMT并使其功能发生改变。实验就TGF-β1对肝癌细胞系Hep3B的作用展开研究:通过CCK8检测TGF-β1对Hep3B细胞增殖的影响,RT-PCR实验检测TGF-β1处理后细胞中EMT及干性相关基因的表达变化。结果表明:TGF-β1对Hep3B细胞的增殖无抑制作用;TGF-β1处理Hep3B细胞6d后EMT相关基因的mRNA表达水平并无显著改变,但TGF-β1可上调Hep3B细胞干性基因Oct-4,Klf-4,Nanog,C-myc的表达,并下调分化基因albumin的表达。结果提示TGF-β1一定程度上影响肝癌细胞系的干性基因表达,但并不一定是以发生EMT为前提的。     

乳腺癌干细胞的研究进展

乳腺癌干细胞(BCSCs)在乳腺癌的发生、发展、治疗抵抗性、转移及复发中起到了关键作用,为此就乳腺癌干细胞的起源,分选鉴定方法和信号通路、微环境等对BCSCs的的调控关系及其在乳腺癌治疗中的意义进行综述。     

CD44、CD133和ABCG2潜在癌症生物标记蛋白质的表达

癌症生物标记物是一种新的早期癌症治疗工具,它既可用于癌细胞抑制,也可用于将其杀灭.癌干细胞已被证明是癌症的一个关键标志细胞.最近,随着单克隆抗体技术的发展生物标记物的研究发展迅速,一些重要的癌干细胞标记已被确认.单克隆抗体是癌标记物应用的重要技术,也是临床诊断和治疗重要手段.本研究的癌干细胞标记物CD44,CD133和ABCG2,分别通过Genestar等软件分析,并选定目标抗原特异性的基板的基因,设计出目标基因的模板和引物.经过免疫分析,设计出编码基因,利用PCR克隆技术,将其并插入预先选定的pGEX-4T-1或pET32a质粒上的克隆位点上.载有预定基因的标记物,通过载体转入感受态的E.coli BL21中,在加入IPTG的条件下,诱导其蛋白质的表达,得到目标蛋白质产物.利用SDS-PAGE和Westem Blot analysis,验证其表达的正确性.研究的目标蛋白质片段CD44、CD133和ABCG2,可以用于癌干细胞进一步的研究和其单克隆抗体的制作.

Abstract：

Cancer biomarkers can provide the chance to develop therapies for cancer during its the natural progression, to either inhibit or eliminate the disease. Cancer stem cells have been proved to be critical in the progression of cancer. Recently,some important cancer stem cells markers have been characterized. The rapid development of cancer biomarker research is attributed to a large extent to the advance of the monoclonal antibody technology. Monoclonal antibodies specific for cancer biomarkers have important clinical use in diagnosis and therapeutics. In the present studies, the cancer stem cell markers,CD44,CD133 and ABCG2 ,were first analyzed for their respective antigenic epitopes by Genestar. Then the gene encoding protein fragment with sound immunogenicity was cloned by PCR and inserted to the multiple cloning site of the pGEX-4T-1 or pET32a plasmid. The resulting expression vector was transformed into the E. coli BL21 strain and the protein expression was induced by the addition of IPTG. Finally,the target protein was characterized by the SDS-PAGE and Western Blot analysis. In further study,these CD44 ,CD133 and ABCG2 target protein fragments will be utilized to develop monoclonal antibodies, which can be used in cancer stem cell research.