纤维素乙醇生产重组酿酒酵母菌株的构建与优化研究进展

寻找化石能源的替代品以及开发和利用生物能源已引起国内外研究者的广泛关注。提高酿酒酵母利用来源广泛、贮存丰富的农林废弃物等木质纤维素原料生产燃料乙醇的效率是生物能源的重要研究内容,但是,重组酿酒酵母木糖发酵性能低是限制纤维素乙醇经济性的关键问题。本文总结了酿酒酵母中木糖代谢途径的构建和优化以及木糖转运对木糖利用的影响,分析了重组酵母利用纤维素水解液进行乙醇发酵的研究现状,并对进一步提高重组酿酒酵母纤维素乙醇生产效率的研究趋势进行了展望。目前国内外已经构建了可有效利用木糖产乙醇的重组酵母,但对其木糖代谢机制的研究还尚未深入,限制了重组菌株的定向改造。此外,目前缺少在纤维素生物质水解液发酵实际应用过程中对重组菌株的评价。因此,加强重组酵母菌株对木糖利用相关代谢调控机理的分析,注重多种抑制物对菌株发酵性能的影响,结合真实底物纤维素乙醇发酵过程进行重组菌株的构建和优化,从而进一步提高纤维素乙醇生产的经济性,是未来菌株构建的重要研究方向。     

低甘油产率的酿酒酵母工程菌构建研究进展

酿酒酵母具有安全、遗传背景清楚、生长速度快、高糖耐受性、高乙醇产量以及高胁迫耐受性等特性,是乙醇生产较为理想的细胞工厂.甘油是酿酒酵母发酵产乙醇过程中的一种主要伴生副产物,过量表达甘油影响糖醇转化率.通过基因工程改造甘油代谢和乙醇生产途径,是降低甘油产量和提高乙醇转化率的有效策略.首先分析改造酿酒酵母细胞中甘油和乙醇代谢路径,阐明甘油在酿酒酵母中生理功能;然后,根据甘油合成途径、分解途径和NAD+/NADH代谢途径,分析低甘油产率的酿酒酵母工程菌构建的技术路径,比较各种基因改造策略对甘油合成和乙醇产率的影响;最后,针对基因整合技术、工程菌遗传稳定型以及工程菌代谢负担加重方面存在的问题,提出可供参考的解决方案,为构建酿酒酵母工程菌高效生产乙醇提供参考.     

LSM蛋白增强木糖发酵重组酵母抗逆性能的研究

木质纤维素原料预处理过程中产生的弱酸、呋喃醛类和酚类化合物等对酿酒酵母的乙醇发酵有抑制作用,提高基因重组酵母对抑制物的耐受性,是利用植物秸秆水解液生产燃料乙醇的关键技术之一。研究从前期构建的戊糖、己糖共发酵重组酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae ZU-E8基因组DNA中克隆出RNA结合蛋白LSM6,将其连入含有PADH启动子的质粒构成表达载体pR-LSM,进而转入ZU-E8宿主细胞中。通过高浓度醋酸根平板筛选,得到高抗逆性木糖发酵重组酵母ZU-910。在醋酸浓度为2 g·L-1的木糖培养基中发酵96 h后,ZU-910的木糖利用率和乙醇浓度为90.2%和26.9 g·L-1,分别是出发菌株ZU-E8的8.5和10倍,并且ZU-910对糠醛和硫酸根的耐受能力也较ZU-E8大大增强。在玉米秸秆酶解液发酵中,ZU-910的木糖利用率和乙醇产量在ZU-E8基础上增加了10.5%和7.7%.证明LSM6蛋白确实能够增强木糖发酵重组酵母的抗逆能力,提高其发酵性能。该研究成果在木质纤维素替代粮食生产乙醇的产业化进程中具有良好的应用前景。     

乙醇浓醪发酵技术研究进展

乙醇浓醪发酵具有高细胞密度、高产物浓度和高生产速率等特点,是乙醇工业的发展目标和方向。采用乙醇浓醪发酵技术,具有节约工艺用水、提高设备利用率、降低能耗等优势,是提高乙醇发酵工业效益的重要途径。研究乙醇浓醪发酵具有十分重要的现实意义。本文综述了乙醇浓醪发酵技术研究进展,介绍了乙醇浓醪发酵定义、优势以及影响乙醇浓醪发酵的因素。指出降低发酵醪液黏度、筛选高耐性酿酒酵母、改变发酵工艺模式、添加适宜酶制剂以及营养物质是实现乙醇浓醪发酵技术的主要途径,其中筛选高耐性的酿酒酵母是实现乙醇浓醪发酵技术的关键。     

过表达谷氧还蛋白基因GRX5提高酿酒酵母乙酸耐性

利用可再生的纤维素原料生产燃料乙醇是国内外研究的热点。但纤维素原料一些预处理过程产生的乙酸对酿酒酵母细胞生长和乙醇发酵产生强烈抑制,因此,提高酿酒酵母细胞的乙酸耐受性是提高纤维素乙醇发酵效率的重要手段。本文研究了谷氧还蛋白家族中GRX5p的编码基因的过表达对酿酒酵母在乙酸胁迫条件下细胞生长和发酵性能的影响。结果表明,过表达GRX5的重组菌株在含有5 g·L^-1乙酸的平板中生长优于对照菌株;在含有5 g·L^-1乙酸的培养基中进行乙醇发酵,过表达GRX5的重组菌株可在48 h基本消耗培养基中所有的葡萄糖,发酵周期比对照菌株缩短了12 h。过表达GRX5菌株的乙醇生产强度为0.897 g·L^-1·h^-1,比对照提高了28.5%。代谢物分析结果表明,过表达GRX5的重组菌株可产生更多的保护性物质海藻糖和甘油,有利于增强菌株胁迫耐受性。     

重金属环境下酵母发酵性能研究

重金属离子对发酵生产乙醇的产率带来一定的影响,因此对重金属环境下酵母发酵性能研究显得尤为重要。本文利用5株重金属耐受性的酵母,通过不同酵母发酵性能分析、重金属迁移分析、酵母在甘蔗汁发酵中重金属吸收情况分析,探讨重金属迁移规律及酵母与重金属相互作用关系。最终得出实验结果：五株酵母细胞发酵行为,主要受Cd和Pb的影响。     

锌离子对自絮凝酵母乙醇耐性和絮凝颗粒大小的影响

研究了6种金属离子在合成培养基中对摇瓶培养的自絮凝酵母乙醇耐性的影响,发现锌离子对高浓度乙醇冲击下的酵母细胞活性有保护作用,并进一步研究了乙醇连续发酵过程中锌的添加对自絮凝酵母乙醇耐性的影响。发酵培养基中分别添加0.01、0.05 和 0.1 g·L^-1的硫酸锌时,自絮凝酵母颗粒平均粒度减小,同时乙醇耐性和高温耐性都得到明显提高,并且发现细胞活性的提高与酵母细胞内麦角固醇和海藻糖的增加密切相关。对酵母细胞内锌的含量的分析表明,3个添加组胞内锌的积累量基本相似,比对照组均增加了6倍。相关性分析表明,酵母胞内锌含量与酵母细胞的胁迫耐性密切相关并显著影响其胁迫耐性。各添加组的乙醇产量均有提高,其中添加0.05 g·L^-1的硫酸锌时乙醇产量最高,比对照组高8.4%。以上研究结果表明,调控连续乙醇发酵过程中培养基中锌离子浓度,是提高酵母细胞乙醇耐受性、高温度耐受性和乙醇产量的有效途径。     

酿酒酵母采用木糖发酵产乙醇的研究现状

酿酒酵母具有安全性好,高产量和高的抑制剂耐受性等优点,故一直在生物乙醇工业中有重要作用。然而该酵母不能使木糖发酵,而木糖是木质纤维素水解产物中重要的戊糖。为了得到利用木糖高效产乙醇的工程茵,我们通过引入初始木糖的新陈代谢和木糖的运输体来改变细胞内的氧化还原平衡．木酮糖激酶的过表达和磷酸戊糖途径来提高乙醇产率。     

与膜耦合的细胞固定化串联发酵制乙醇的研究

利用植物纤维作为廉价的糖源生产燃料乙醇是解决世界能源危机的最有效途径.今研究采用海藻酸钙固定普通酿酒酵母细胞和嗜鞣管囊酵母细胞于两个串联的发酵罐内,连续发酵葡萄糖和木糖组成的糖液并与膜耦合来制取酒精.通过硅橡胶膜(PDMS)的渗透蒸发过程,将产品乙醇从发酵液中移出,减少了产物乙醇对发酵的抑制作用.实验结果表明,这套采用海藻酸钙固定酵母细胞进行连续发酵并与膜耦合的生物反应器系统,在稀释率为0.321 h-1下稳定运行,剩余葡萄糖和木糖浓度分别为0.134、4.921 g·L-1,乙醇得率为O.457 g(乙醇)·g-1(糖),是理论得率的92.64%.生产能力达到10.996 g·L-1·h-1.与其它发酵方式相比较,用海藻酸钙来固定细胞并与膜耦合的发酵过程可增大酵母细胞浓度,明显降低乙醇对酵母的抑制作用,并提高糖的转化率.     

木块填料对高浓度乙醇连续发酵过程中振荡行为的弱化机制

前期研究发现,添加木块填料可有效弱化管式反应器中的振荡行为,并推测其机理可能与酵母细胞的固定化、酵母细胞生长微环境的改变和管式反应器中稀释速率的改变三方面因素有关。本文实验证明了木块填料反应器的稀释率的改变不是导致振荡弱化的主要原因。进一步研究表明：一方面,与其他填料体系相比,木块填料体系不仅维持了较高的生物量浓度,而且维持了较高的细胞活性,从而具备了弱化振荡的前提条件;另一方面,与无填料体系培养出的酵母细胞相比,木块填料体系培养的酵母细胞具有较高的乙醇耐受性,从而弱化了乙醇浓度变化导致的发酵参数的大幅度波动。     

锌离子提高絮凝酵母高浓度乙酸胁迫耐受性的研究

研究了锌离子对絮凝酵母SPSC01乙酸胁迫条件下乙醇发酵的影响,结果表明,添加适当浓度的锌离子可以缓解乙酸对自絮凝酵母生长的抑制,进而缩短其发酵周期;其中添加0.03 g?L-1锌离子对乙酸胁迫下细胞活性的保护作用最明显,可使15 g?L-1乙酸存在时发酵周期缩短近30 h,最终生物量得率提高 27.8%,乙醇产率提高66.7%。同时锌离子还可以使乙酸抑制条件下,发酵液中副产物乳酸和丙酸的含量降低。     

淀粉质燃料乙醇发酵胁迫及菌株耐受性改造

在淀粉质燃料乙醇生产过程中,酿酒酵母面临的多重胁迫严重制约了燃料乙醇的生产效率。针对这一现状,该文结合国内淀粉质燃料乙醇主要生产工艺,综合分析了该工艺下燃料乙醇发酵过程中影响酿酒酵母生长和生产的各种胁迫因素;阐述了微生物对不同胁迫因子的抗逆分子机制;介绍了菌株耐受性改造的方法;提出实现菌株全局的耐受性和鲁棒性,并且开发基于全基因组的快速进化方法是未来工业微生物耐受性改造的方向。     

Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae

During hydrolysis of lignocellulosic biomass, monomeric sugars and a broad range of inhibitory compounds are formed and released. These inhibitors, which can be organized around three main groups, furans, weak acids and phenolics, reduce ethanol yield and productivity by affecting the microorganism performance during the fermentation step. Among the microorganisms that have been evaluated for lignocellulosic hydrolysate ethanol fermentation, the yeast Saccharomyces cerevisiae appears to be the least sensitive. In order to overcome the effect of inhibitors, strategies that include improvement of natural tolerance of microorganism and use of fermentation control strategies have been developed. An overview of the origin, effects and mechanisms of action of known inhibitors on S. cerevisiae is given. Fermentation control strategies as well as metabolic, genetic and evolutionary engineering strategies to obtain S. cerevisiae strains with improved tolerance are discussed. Copyright © 2007 Society of Chemical Industry     

气提法弱化超高浓度乙醇发酵过程中自絮凝酵母振荡行为

超高浓度(very high gravity,VHG)连续乙醇发酵过程中的振荡行为会导致发酵终点的乙醇浓度振荡和降低,是VHG连续乙醇发酵面临的主要问题。研究表明,游离酵母Saccharomyces cerevisiae 4126和自絮凝酵母BHL01在VHG连续乙醇发酵过程中,生物量、残糖、乙醇、甘油等发酵参数都呈现130～145 h的周期性振荡,且絮凝酵母发酵体系的平均乙醇浓度和乙醇生产强度都明显高于游离酵母体系。在絮凝酵母VHG连续乙醇发酵过程中利用发酵尾气气提分离乙醇,酵母细胞振荡行为被明显弱化,达到拟稳态状态,并且使发酵液中的残糖浓度控制在0.1 g·L^-1以下,平均乙醇浓度为110.87 g·L^-1,乙醇产率达到2.99 g·L^-1·h^-1。因此,本研究为弱化VHG连续乙醇发酵中的参数振荡行为提供了新的技术手段。     

Effect of different fermentation parameters on bioethanol production from corn meal hydrolyzates by free and immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus

BACKGROUND: Bioethanol produced from renewable biomass, such as corn meal, is a biofuel that is both renewable and environmentally friendly. Significant scientific and technological investments will be needed to achieve substitution of conventional fossil fuels with alternative fuels. The ethanol fermentation of enzymatically obtained corn meal hydrolyzates by free and immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus yeast in a batch system was studied. The initial glucose and inoculum concentration and the time required for the efficient ethanol production were optimized taking into account parameters such as ethanol concentration, ethanol yield, percentage of the theoretical yield of ethanol and volumetric productivity in both immobilized and free cell systems. RESULTS: The yeast cells were immobilized in Ca–alginate by an electrostatic droplet generation method. An optimal initial inoculum concentration of 2% (v/v) and optimal fermentation time of 38 h for both immobilized and free yeasts were determined. An optimal initial glucose concentration of 150 g L^?1 for free system was achieved. At the initial glucose concentration of 176 g L no substrate or product inhibition were achieved with immobilized yeast. CONCLUSION: By immobilization of the yeast into Ca–alginate using the method of electrostatic droplet generation a superior system was realized, which exhibited lower substrate inhibition and higher tolerance to ethanol. The cells of S. cerevisiae var. ellipsoideus yeast entrapped in Ca–alginate showed good physical and chemical stability, and no substrate and product diffusion restrictions were noticed. Copyright © 2008 Society of Chemical Industry     

固定化酵母乙醇萃取发酵研究

以十二烷醇为萃取剂，对固定化酵母乙醇萃取发酵进行了研究。探讨了萃取剂对酵母细胞的毒性，以及萃取剂用量、搅拌转速、基质浓度等因素与乙醇萃取发酵的关系，并测定了萃取过程中乙醇的分配系数。为固定化酵母乙醇发酵与溶剂萃取耦合新工艺的开发研究提供了资料。     

Fate of free amino nitrogen during liquefaction and yeast fermentation of maize and sorghums differing in endosperm texture

Biofuels demands have motivated the increasing research in production technology as well as effective raw material utilization. Fusel alcohol production had been related with the free amino nitrogen (FAN) content produced during hydrolyses stages and also as a stress response of Saccharomyces cerevisiae. This paper analyses the effect of grain type and endosperm texture on FAN production during starch liquefaction and yeast fermentation of maize, white and red sorghums bioconverted into ethanol. The white sorghum had a harder endosperm texture and upon milling produced a coarser granulation compared to the red counterpart. Therefore, the red sorghum produced higher amounts of FAN during liquefaction and the kinetics of these nitrogenous compounds were metabolized faster during the first hours of yeast fermentation. The white and red sorghums yielded 13.6% and 2.7% lower ethanol compared to the maize counterpart. The white sorghum yielded the lowest amount of ethanol likely to its relatively harder endosperm texture that was less susceptible to biocatalysis and yeast fermentation.     

同步闪蒸汽提发酵制乙醇

为提高乙醇生产发酵强度,提出了同步汽提闪蒸乙醇发酵新过程。该过程集合了闪蒸发酵和汽提发酵的优点,在发酵的同时能更有效地在位分离乙醇,从而提高发酵强度。通过与普通发酵、闪蒸发酵、汽提发酵等过程进行间歇实验比较,同步闪蒸汽提发酵过程具有发酵强度高的优势;而且,采用耐高温酵母高温发酵、提高通气量、闪蒸罐的进料流速可进一步提高其发酵强度。该过程简单、高效,具有工业应用的潜力。