解脂耶氏酵母产脂肪酶的研究进展

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种非常规酵母,能够利用多种底物分泌产生大量的脂肪酶,因此,该物种作为一种新型的工业用菌逐渐引起了学者的广泛关注。该文总结了解脂耶氏酵母产脂肪酶的特点、脂肪酶的编码基因、脂肪酶的活性及生产方法研究进展,并分别阐述了脂肪酶在环境治理、食品工业、生物柴油以及家禽养殖业四个方面的应用,目的在于阐明酵母生产脂肪酶的研究现状及应用前景,为探究脂肪酶新的生产方式及新用途提供依据。     

欧盟认定解脂耶氏酵母生物质安全性

正日前,欧洲食品安全局就解脂耶氏酵母生物质(Yarrowia lipolytica Yeast biomass)作为新型食品的安全性发布意见。应欧盟委员会的要求,欧盟膳食、营养和过敏症科学小组(NDA)根据法规(EU)2015/2283,就解脂耶氏酵母生物质作为新型食品提供科学意见。这种新型食品的目标人群是3岁以上的普通人群,对于3岁以上、10岁以下的儿童,建议每日最高用量为3克,10岁以上的人群建议每日最高用量为6克。     

解脂耶氏酵母在食品工业中的应用

解脂耶氏酵母是一类非常规酵母,由于该酵母独特的理化性质、代谢特点被广泛应用于各个行业。因其属于广泛认为是安全的(generally regarded as safe,GRAS)微生物而被广泛应用于食品工业。文中主要对该酵母在食品工业中的应用进行总结,介绍其在生产奶类和肉制品中的应用,参与芳香族化合物生产,引起食品腐败,生产多元醇以及有机酸,生产表面活性剂和乳化剂,作为单细胞脂类及单细胞蛋白,食品垃圾的降解及转化。旨在阐明解脂耶氏酵母在食品工业中的重要性及广阔的应用前景。     

葡萄糖氧化酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及发酵优化

葡萄糖氧化酶(β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase;EC 1.1.3.4,简称GOD)是生物领域中至关重要的工具酶之一,被广泛应用于食品工业、饲料工业、纺织、医药等行业中。作者构建了一株重组解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica 1-28,分泌GOD,并进一步运用单因素实验与正交实验在摇瓶水平对其发酵培养基进行了优化。实验结果显示,最佳发酵培养基配方为:甘油20 g/L,酵母膏2.64 g/L,氯化铵2.64 g/L,无水硫酸镁0.13 g/L,磷酸二氢钾0.32 g/L,维生素B13.34×10-4g/L,初始pH值6.0。优化后GOD发酵产量达到11.0 U/mL,较初始发酵培养基GOD产量提高了72%。在此基础上进行3 L罐发酵,重组菌在甘油补料30 g/L,pH为5.0时,28℃发酵190h,发酵液酶活达到81.6 U/mL。     

解脂耶氏酵母URA3基因的敲除

构建了营养缺陷型解脂耶氏酵母菌株,使之用于遗传标记和高产香味物质γ-癸内酯.作者利用基因同源重组的方法敲除掉尿嘧啶合成酶关键基因URA3基因,用尿嘧啶营养缺陷型培养基(SD-URA)添加一定浓度的5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶筛选获得转化子.实验表明:尿嘧啶营养缺陷型菌株在含有5-FOA和尿嘧啶的培养基上生长而野生型菌株不生长,从而建立了一种快速获得营养缺陷型解脂耶氏菌株的方法.     

重组解脂耶氏酵母生产谷氨酰胺转胺酶酶原的发酵优化

谷氨酰胺转胺酶(EC2.3.2.13,TGase)是一种重要的食品酶,广泛应用于食品组分的质构、起泡性及乳化性等功能性质的改善。以一株分泌谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-TGase)的重组解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica BBETG为研究对象,结合单因素实验与正交实验对其发酵培养基进行优化,以期实现pro-TGase的高产。结果表明,较优的发酵培养基配方为:甘油15 g/L、酵母膏20 g/L、氯化铵2.64 g/L、KH2PO4 0.32 g/L、无水MgSO4 0.25 g/L、VB13.34×10-4 g/L,初始pH值8.0。在该培养基中,重组菌于28℃发酵120 h,获得的pro-TGase经体外活化,酶活达8.47 U/mL,较初始发酵培养基产量提高393%。     

解脂耶氏酵母作为微生物细胞工厂的应用研究进展

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种重要的工业微生物菌种,被公认为食品级安全微生物。近年来,随着合成生物学和基因编辑技术的快速发展,科学家们利用合成生物学及基因编辑技术已经成功构建出了能够生产生物化学品、生物燃料、香料、药物、工业酶和药用蛋白等多种高附加值工业产品的解脂耶氏酵母细胞工厂,使得该酵母在食品、药品和生化能源等领域均具有巨大的应用潜力。本文将重点介绍解脂耶氏酵母表达系统、合成生物学元件和基因编辑方法的最新研究进展和应用情况,并对近年来以解脂耶氏酵母作为微生物细胞工厂生产高附加值产品的应用实例进行总结,希望为研究人员进一步利用解脂耶氏酵母进行底盘细胞设计、构建和优化相关合成途径并最终实现目的产物的高效合成提供有用的信息。     

超高压对解脂耶氏酵母脂肪酶酶活的影响

研究了超高压体系中,压力、温度、pH和保压时间对解脂耶氏酵母脂肪酶活性的影响。结果表明:在超高压作用下,解脂耶氏酵母脂肪酶的活性有所提高;经正交试验优化得到在压力450 MPa、温度45℃、pH 7.5、保压时间10 min条件下,脂肪酶活性最高,为同等条件下常压处理的脂肪酶活性的220%。经高压处理后,脂肪酶的最适pH较常压条件下向碱性方向移动0.5。     

氮源对解脂耶氏酵母合成共轭亚油酸的影响

为了提高解脂耶氏酵母重组菌株合成反-10,顺-12-共轭亚油酸的产量,以YNBDSa为发酵培养基进行摇瓶发酵,研究氮限制策略及氮源种类对菌株合成脂肪酶Lip2、亚油酸异构酶PAI及反-10,顺-12-共轭亚油酸产量的影响。结果表明:高氮培养基更利于菌体生长以及产物的合成,反-10,顺-12-共轭亚油酸产量达到4.3 g/L,是低氮培养基对应结果的8.6倍;采用有机氮为氮源时,Lip2酶活及PAI表达量显著高于无机氮的结果,反-10,顺-12-共轭亚油酸产量最高达到4.6 g/L,是无机氮结果的46倍。     

常压室温等离子体诱变选育高产脂肪酶解脂耶氏酵母

采用常压室温等离子体(Atmospheric room temperature plasma,ARTP)对产脂肪酶的解脂耶氏酵母菌株YL1进行诱变;通过三丁酸甘油酯平板法、p-NPP法以及酸碱滴定法等筛选得到高产脂肪酶的目标菌株C4,并研究其遗传稳定性。结果表明,解脂耶氏酵母菌株YL1的最佳诱变时间为60s,菌株致死率达97.45%;突变株C4的脂肪酶酶活为13.4 U/mL,较出发菌株提高了82.6%,多代培养后遗传稳定;与出发菌株相比,突变株脂肪酶可使维生素A棕榈酸酯的合成转化率提高36.9%。     

欧盟批准解脂耶氏酵母生物质作为新型食品投放市场

<正>据欧盟官方公报消息,2019年5月14日,欧盟委员会发布(EU) 2019/760号条例,批准解脂耶氏酵母生物质(Yarrowia lipolytica yeast biomass)作为新型食品投放市场,并修订实施细则(EU) 2017/2470的附件。主要修订如下:将解脂耶氏酵母生物质将列入实施法规(EU) 2017/2470中建立的授权新型食品的清单     

欧盟批准解脂耶氏酵母生物质作为新型食品投放市场

<正>据欧盟官方公报消息,2019年5月14日,欧盟委员会发布(EU)2019/760号条例,批准解脂耶氏酵母生物质(Yarrowia lipolytica yeast biomass)作为新型食品投放市场,并修订实施细则(EU)2017/2470的附件。主要修订如下:将解脂耶氏酵母生物质将列入实施法规(EU)2017/2470中建立的授权新型食品的清单中。规定在指定食品类别"指令2002/46/EC中定义的     

解脂耶氏酵母lip2脂肪酶水解谷维素产生阿魏酸的研究

对解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)脂肪酶水解谷维素产生阿魏酸的酶反应体系进行了研究。实验发现解脂耶氏酵母全脂肪酶粉(105U/mg)在50mmol/L p H7.0 Tris-HCl(含7.5mmol/L黄胆酸钠),100mmol/L p H6.0磷酸钠缓冲液(含1000U脂肪酶)的体系中,水解产生阿魏酸的得率为2.94%。为了进一步提高脂肪酶水解效率,对解脂耶氏酵母脂肪酶中主要组分lip2脂肪酶基因进行了克隆,整合至毕赤酵母GS115基因组后发酵制取lip2脂肪酶粉(70.1U/mg),于上述酶解体系中进行水解谷维素实验。实验结果表明阿魏酸产率为2.87%。获得的lip2脂肪酶催化效率略低于全脂肪酶粉催化效率,但是获得了单一的脂肪酶基因,为进一步采取分子进化技术提高其催化能力奠定了基础。     

尼罗红荧光光谱法快速测定解脂耶氏酵母油脂含量的研究

为了建立快速简便检测解脂耶氏酵母油脂含量的方法,探讨了尼罗红-光谱法测定解脂耶氏酵母油脂含量的检测条件。通过研究解脂耶氏酵母最佳发射光波长、细胞密度、尼罗红染液用量、染色时间、不同助溶剂效能及最佳体积分数对荧光强度的影响,确定了最佳检测条件,得到细胞油脂含量与荧光强度的线性关系。解脂耶氏酵母在激发光560 nm、发射光650 nm处有最高荧光值,每毫升菌液加入质量分数为0.1 mg/m L的尼罗红染液20μL,加入体积分数为15%的异丙醇,黑暗染色5 min,在细胞OD600=0¹.3的范围内,菌液的油脂含量（X）与荧光值（Y）呈较好的线性关系,线性关系式为Y=6.3651X+10.097,R2=0.9902,灵敏度达0.0001 g。该方法能够准确地反映出解脂耶氏酵母胞内油脂含量。尼罗红-荧光法可成为一种快速检测解脂耶氏酵母胞内油脂含量的新方法。      

田口设计优化解脂耶罗维亚酵母产油发酵培养基

本研究以粗甘油为碳源通过田口设计对解脂耶罗维亚酵母产油脂的培养基进行优化。首先通过单因素实验得到对结果影响最显著的因素,在单因素实验的基础上利用Minitab 17设计田口式正交实验,对实验中各因素水平的均值和信噪比进行分析。结果表明培养基中的C/N和MgSO₄·7H₂O的浓度对油脂产量有极显著影响,CaCl₂的浓度有显著影响。最佳培养基组成为C/N为100∶1（粗甘油50 g/L,硫酸铵1.08 g/L）,MgSO₄·7H₂O 3 g/L,CaCl₂ 0.2 g/L,KH₂PO₄ 4 g/L。使用最佳培养基配方在28℃180 r/min条件下培养4 d,油脂产量达到1.859 g/L,与田口设计的预测结果 1.782 g/L接近,相对于未优化时油脂产量提高了48.5%。      

田口设计优化解脂耶罗维亚酵母产油发酵培养基

本研究以粗甘油为碳源通过田口设计对解脂耶罗维亚酵母产油脂的培养基进行优化。首先通过单因素实验得到对结果影响最显著的因素,在单因素实验的基础上利用Minitab 17设计田口式正交实验,对实验中各因素水平的均值和信噪比进行分析。结果表明培养基中的C/N和MgSO_4·7H_2O的浓度对油脂产量有极显著影响,CaCl_2的浓度有显著影响。最佳培养基组成为C/N为100∶1(粗甘油50 g/L,硫酸铵1.08 g/L),MgSO_4·7H_2O 3 g/L,CaCl_2 0.2 g/L,KH_2PO_4 4 g/L。使用最佳培养基配方在28℃180 r/min条件下培养4 d,油脂产量达到1.859 g/L,与田口设计的预测结果 1.782 g/L接近,相对于未优化时油脂产量提高了48.5%。     

不同培养基对耶氏解脂酵母合成共轭亚油酸的影响

为了提高共轭亚油酸(CLA)在耶氏解脂酵母重组菌株中的产量,选择YEA、YPD、YP2D4、YNBDO2和YNBDL25种培养基,对其进行摇瓶发酵,分析其生长状态,并利用气相色谱法测定菌体中的总脂含量及脂肪酸组成.结果表明:培养基中充足的碳源和氮源是提高菌体生物量及重组蛋白表达量的前提;在培养基中添加脂肪酸显著提高了菌体中的总脂含量和t10,c12-CLA产量;在5种培养基中,YNBDL2是最适合t10,c12-CLA合成的培养基,其培养基中t10,c12-CLA产量为185.8 mg/L,是YPD培养基中t10,c12-CLA产量的13倍.     

解脂耶氏酵母β氧化基因敲除菌的构建及挥发性脂肪酸的利用

为了抑制解脂耶氏酵母长链脂肪酸的β氧化,使其稳定地积累,通过基因调控途径构建了4株脂肪酸β氧化基因敲除菌株,并研究了重组菌株利用挥发性脂肪酸作为碳源合成长链脂肪酸的能力。结果表明:分别敲除pox2、pox3和pex10的3株单基因敲除菌株及同时敲除pox2和pox3的组合基因敲除菌株构建成功,4株重组菌株均可以利用挥发性脂肪酸进行生长。与原始菌株相比,polf-Δpox2Δpox3和polf-Δpex10总脂产量(长链脂肪酸总和)在发酵后期并未因脂肪酸的β氧化而出现明显下降,是可以利用挥发性脂肪酸且可实现脂质积累的重组菌株。     

代谢工程改造解脂耶氏酵母生产油脂研究进展北大核心CSCD

微生物油脂是可再生能源发展的重要方向,近年来通过合成生物学方法和代谢工程技术改造,解脂耶氏酵母的产油水平提高迅速,展现了良好的应用发展前景。从代谢途径关键酶调控、负反馈调节解除、代谢途径关键酶异源表达、乙酰辅酶A和NADPH替代途径构建、强化氧化应激保护、促进脂肪酸分泌、适应性进化和计算机辅助模拟8个方面,梳理总结了代谢工程改造解脂耶氏酵母生产油脂的最新研究进展。通过对现有研究分析发现,廉价底物中的毒性成分影响细胞生长和油脂合成,以及油脂调控网络机制的不完全明晰,是限制解脂耶氏酵母油脂产量提升的主要障碍。为此,可通过设计引入解毒途径,添加解毒剂,或筛选毒性化合物耐受菌,以及利用多组学技术和计算机辅助优化进一步解析代谢调控机制解决此问题。此外,在“双碳”背景下,可在解脂耶氏酵母中引入高效的人造光合作用或碳固定途径,利用二氧化碳生产油脂。