CHO宿主细胞DNA残留量检测方法的建立

目的建立检测生物制品中CHO宿主细胞DNA残留量的方法,制备检测CHO细胞DNA残留量的内部参考品,为国家相关标准的制定和修订提供依据。方法分别采用酚:氯仿:异戊醇抽提、DNA提取试剂盒和高盐抽提3种方法提取CHO细胞DNA,比较3种方法的提取效果;用地高辛标记最佳方法提取的CHO细胞DNA探针,并优化标记体系,直接法检测探针的标记效率;采用3种方法处理CHO细胞DNA内部参考品(1组不作处理;2组加入牛血清白蛋白和蛋白酶K;3组按2组方法处理后,增加DNA抽提步骤),通过点杂交法,用标记的探针检测上述样品的灵敏度。结果高盐抽提法提取的CHO细胞DNA效果较好;体系4(DNA10μg,Vial416μl,总体积64μl)标记效率最高;经不同方法处理的1、2、3组CHO细胞DNA内部参考品的检测灵敏度分别为1pg、10pg和1ng。结论建立的地高辛标记CHO细胞DNA探针-点杂交检测CHO细胞DNA残留量的方法稳定可靠,可用于生物制品中CHO宿主细胞DNA残留量的检测。     

质粒DNA中宿主菌基因组DNA残留检测方法的比较

目的对检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA含量的Southern blot和Real-time PCR法进行比较。方法PCR扩增宿主菌染色体DNA的16SrRNA片段,以地高辛标记回收的目的片段为探针,对提取的质粒pcDNAH进行Southern blot,同时根据16SrRNA基因序列设计探针,建立Real-time PCR反应体系和标准曲线,分别检测质粒中宿主菌基因组DNA的含量。结果应用Southern blot和Real-time PCR检测质粒pcDNAH中宿主菌基因组DNA的含量,结果均符合WHO相关标准。结论两种检测方法各有优缺点,均可用于检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA的残留,可根据不同情况,采用不同方法或配套使用。     

地高辛标记探针检测Vero细胞残余DNA试验条件的改进

<正>目前,应用地高辛标记探针检测Vero细胞残余DNA含量仍是最常用的检测方法,该方法具有特异性强、无放射污染、操作简便等特点。在实际操作中,地高辛探针的灵敏度及杂交的条件对检测结果均有很大的影响。为此,我们就提高探针灵敏度及优化杂交条件进行了摸索。     

应用地高辛标记HCMV DNA混合探针检测人巨细胞病毒DNA

本文比较了~(32)P和地高辛标记的HCMV EcoRI单一Z片段与EcoR IZ、K、J混合片段探针的敏感性。结果~(32)P和地高辛分别标记的EcoRIZ单一片段检测敏感性分别为50pg和1pg,而两者标记的EcoRI Z、K、J混合片段检测敏感性分别提高到5pg和0.1pg。地高辛标记的混合片段探针比~(32)P标记单一EcoRIZ片段探针敏感性提高500倍,比~(32)P标记混合探针高50倍,比地高辛标记的EcoRI Z片段探针高10倍。应用地高辛标记混合片段探针检测了正常小儿尿标本10份,阳性率为60％(6/10),与免疫组化方法对比,两者符合率为100％。检测肾移植患者尿标本33份,阳性率为46％(15/33);白血病患者尿标本18份,阳性率为72％(13/18),与PCR方法对比两者符合率为93％。地高辛标记混合探针可快速、敏感、特异地检测人巨细胞病毒感染。     

用光敏生物素标记的探针检测人用鼠源单抗中残余DNA

将培养至对数期的Ag8．653小鼠骨髓癌细胞经裂解、抽提、RnaseA处理和纯化，获得A260nm／A28nm，为2.013、电泳为一条区带的纯化的小鼠骨髓瘤细胞全DNA；该DNA经不同处理，标记两个探针，即全DNA通过缺口转移法，用‘中标记和全DNA用光敏生物素（军事医学科学院二所提供）标记。在比较灵敏度时，将纯化的未标记的小鼠骨髓癌细胞全DNA分别点在两张硝酸纤维膜上（每张膜上分别含20Pg、10pg和5pg），再用’于和光敏生物素标记的探针分别与这两张膜进行斑点杂交。在用光敏生物素标记的探针检测单抗样品时，随机取3批单克隆抗体（分别经…     

重组人肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗外源DNA残留量检测方法的建立

目的建立重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗原液中昆虫细胞宿主DNA残留的地高辛探针杂交检测方法。方法抽提昆虫细胞sf9基因组DNA,经分子筛纯化后作为阳性对照品;分别以1 000~5 000 bp和100~1 000 bp的基因组DNA超声随机小片段为模板,制备地高辛探针,与阳性对照进行杂交试验。同时验证方法的检测范围、灵敏度和特异性,并采用该方法对3批重组EV71 VLPs疫苗原液中宿主DNA残留量进行测定。结果纯化后DNA样品浓度为47. 5 ng/μL,A260/A280值为1. 86,可作为阳性对照。以100~1 000 bp DNA超声随机小片段作为模板,探针标记效率更高,杂交显色更清晰。该法检测范围为10 pg^10 ng,灵敏度达1 pg,特异性强。3批重组EV71 VLPs疫苗原液中每人份剂量的宿主细胞DNA残留均<50 pg。结论本实验建立的方法特异性强,灵敏度高,可用于重组EV71 VLPs疫苗制备过程中的原液检定及质量控制。     

量子点标记DNA的应用与进展

量子点作为新型纳米微晶,在生物标记方面有着无与伦比的应用前景.综述了量子点标记DNA的方法,以及量子点-DNA探针在检测DNA、蛋白质及DNA之间相互作用等领域的最新应用和进展.并对DNA探针在未来的应用进行了展望.     

金黄葡萄球菌核酸探针检测方法的建立

目的建立快速检测食品中金黄葡萄球菌的核酸探针检测法。方法通过使用吖啶酯标记的特异DNA探针检测金黄葡萄球菌,确定最高和最低探针浓度,验证该方法的特异性及敏感性,并与传统国标法的检测结果进行比较。结果核酸探针法最高探针浓度为2pmol∕50μl,最低探针浓度为0.25pmol∕50μl;该方法特异性良好,检出纯培养菌落最低限约为106cfu∕ml;与国标法检测结果一致性较高。结论核酸探针法可用于食品中金黄葡萄球菌的快速检测。     

应用PCR法检测患者尿中人巨细胞病毒DNA

在人巨细胞病毒(HCMV)基因组早期蛋白基因处设计了一对引物,通过链聚合酶反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增一段长106bp的特异性序列,用来检测样品中HCMV DNA。以此方法检测正常儿童尿标本阳性为15％(3/20),白血病患者尿阳性为76.2％(16/21),肾移植患者尿阳性为40％(13/33)。同时对部分标本进行了Dig标记的HCMV DNA探针法检测,结果PCR法检测的阳性率比Dig标记探针法高。     

实时荧光PCR法快速检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株

目的建立一种敏感、特异、快速的实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株的方法,为临床治疗提供指导。方法设计引物和TaqMan-MGB探针,利用TaqMan-MGB探针技术,建立实时荧光定量PCR法。检测临床HBV-YMDD变异标本36份和野生型HBV标本20份,并将其YMDD变异结果与DNA测序结果进行比较。结果该方法检测灵敏度为101拷贝/μl;特异性为100%;最低检测限度为101DNA拷贝/30μl反应体系;实时荧光PCR方法测得YMDD野生株20份,变异株36份,与DNA测序结果完全一致,符合率为100%。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测YMDD变异株基因,具有灵敏、特异和精确等优点,对临床监测拉米夫定耐药具有重要意义。     

应用生物素探针检测重组人α_1型干扰素中外源DNA

本文应用生物素标记重组人α_1 型干扰素(rHuIFN-α_1)工程菌的总DNA作为探针,检测rHuIFN-α_1制品中的外源DNA,其灵敏度可达10pg。用蛋白酶K(Proteinase K)消化制品中的蛋白,排除了使用生物素所常见的非特异性影响。     

应用光敏生物素探针检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA

用国产光敏生物素,标记Veto细胞全DNA,通过与疫苗中同源DNA的狭缝杂交,检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA含量。检测灵敏度可达1pg。探针稳定长达一年。杂交反应特:异性高,结果重复性好。与同位素探针相比,生物素标记探针简便、经济、快速、稳定。由本法测得,Vero细胞乙脑粗制疫苗中,含DNA为200～400pg/0.5ml;超滤浓缩苗为4×10~4～6×10~6pg/0.5ml;通过柱层析和沉淀法提纯的疫苗则分别低于60pg/0.5ml和1pg/0.5ml。本法同样适用于传代细胞制备的其它生物制品中细胞残余DNA的检测。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒基因探针的制备及应用

本文从克隆化的HSV-1 EcoRI-H片段重组菌株中分离重组质粒DNA。经酶切、低熔点琼脂糖凝胶电泳分离出目的基因HSV-1 EcoRI-H片段DNA(13.5Kb)。用缺口翻译法制备a-~(32)P标记探针。通过斑点杂交试验检测10例临床样品及阳阴性对照病毒标准株。结果表明,该探针只与单纯疱疹病毒DNA杂交,而不与腺病毒Ⅲ型(Ad_3)、痘苗病毒(VV)、Vero细胞DNA杂交。且可检测出至少5pg的同源序列DNA。表明该探针具有良好的特异性和敏感性。检测的10例临床标本有两例出现阳性,与病毒分离培养结果一致。     

DNA分子杂交技术在基因工程人白细胞介素-2质量检测中的应用

将携带有人白细胞介素-2基因的工程菌(PBV~(220)/ZL-2),发酵培养后经一系列提纯可获得基因工程人白细胞介素-2(rIL-2)的纯品。采用分子杂交技术,用~(32)P标记PBV_(220)大肠杆菌全DNA为探针,检测rlL-2纯品,没有检测出残余DNA,完全符合WHO和“中国人用重组DNA制品质量控制要点”所规定的残余DNA含量在100Pg/剂以下的要求。     

A chelating dendritic ligand capped quantum dot: preparation, surface passivation, bioconjugation and specific DNA detection

Herein we report the synthesis of a new chelating dendritic ligand (CDL) and its use in the preparation a compact, stable and water-soluble quantum dot (QD), and further development of specific DNA sensor. The CDL, which contains a chelative dihydrolipoic acid moiety for strong QD surface anchoring and four dendritic carboxylic acid groups, provides a stable, compact and entangled hydrophilic coating around the QD that significantly increases the stability of the resulting water-soluble QD. A CDL-capped CdSe/ZnS core/shell QD (CDL-QD) has stronger fluorescence than that capped by a monodendate single-chain thiol, 3-mercapto-propionic acid (MPA-QD). In addition, the fluorescence of the CDL-QD can be enhanced by 2.5-fold by treatments with Zn2+ or S2- ions, presumably due to effective passivation of the surface defects. This level of fluorescence enhancement obtained for the CDL-QD is much greater than that for the MPA-QD. Further, by coupling a short single-stranded DNA target to the QD via the CDL carboxylic acid group, a functional QD-DNA conjugate that can resist non-specific adsorption and hybridize quickly to its complementary DNA probe has been obtained. This functional QD-DNA conjugate is suitable for specific quantification of short, labelled complementary probes at the low DNA probe:QD copy numbers via a QD-sensitised dye fluorescence resonance energy transfer (FRET) response with 500 pM sensitivity on a conventional fluorimeter.     

Parts Per Trillion Detection of 7-Aminonitrazepam by Nano-Enhanced ELISA

It is challenging to detect 7-aminonitrazepam (7-ANZP) residue in animal tissues simply and sensitively by the enzyme-linked sorbent immunoassay (ELISA) method. This paper demonstrates that utilizing a bioconjugate of gold nanoparticles and enzyme-labeled antibody as a signal probe increases the sensitivity of a traditional ELISA for 7-ANZP by nearly 20 times. The sensitivity of this ELISA for 7-ANZP was 5.6 pg/mL in buffer, and the limit of detection (LOD) of 0.18 μg/kg for 7-ANZP in urine could be achieved after the urine samples were simply hydrolyzed and diluted by buffer. This simple and sensitive method has potential application for improving the sensitivity of ELISA methods against various small molecules.     

应用光敏生物素标记探针检测杂交瘤细胞中小鼠白血病病毒

采用BamHⅠ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术，从重组质粒pSF11中回收5kb小鼠白血病病毒（MuLv）DNA片段，用光敏生物素标记制备DNA探针，采用斑点杂交法检测杂交癌细胞，McAb纯品以及SP2／0细胞中的MuLv。结果表明，此探针特异性好，灵敏度可达25pg。在检测的13株杂交瘤细胞和2株SP2／0细胞中分别有5株和1株为MuLv阳性，在McAb纯品中未查出MuLv。     

Bivalent Display of Dicysteine on Peptide Nucleic Acids for Homogenous DNA/RNA Detection through in Situ Fluorescence Labelling

Fluorogenic probes that signal the presence of specific DNA or RNA sequences are key enabling tools for molecular disease diagnosis and imaging studies. Usually, at least one fluorophore is attached through covalent bonding to an oligonucleotide probe. However, the additional conjugation step increases costs. Here we introduce a method that avoids the requirement for the preparation of fluorescence‐labelled oligonucleotides and provides the opportunity to alter the fluorogenic reporter dye without resynthesis. The method is based on adjacent hybridization of two dicysteine‐containing peptide nucleic acid (PNA) probes to form a bipartite tetracysteine motif that binds profluorescent bisarsenical dyes such as FIAsH, ReAsH or CrAsH. Binding is accompanied by strong increases in fluorescence emission (with response factors of up to 80‐fold and high brightness up to 50 mL mol^?1 cm^?1). The detection system provides sub‐nanomolar limits of detection and allows discrimination of single nucleotide variations through more than 20‐fold changes in fluorescence intensity. To demonstrate its usefulness, the FIAsH‐based readout of the bivalent CysCys‐PNA display was interfaced with a rolling‐circle amplification (RCA) assay used to detect disease‐associated microRNA let‐7a.     

以亚甲基蓝为杂交指示剂的DNA电化学传感器

构建了一个以亚甲基蓝(MB)为杂交指示剂的电化学DNA传感体系:通过自组装的方式将巯基改性的单链DNA5′端(HS-ssDNA)连接到金电极表面形成Au-ssDNA,当检测体系中加入和Au-ssDNA互补的目标单链DNA(cssDNA)时,会形成一个双链DNA系统(Au-dsDNA),加入MB并通过循环伏安法检测了杂交过程中的信号变化,验证了Au-ssDNA及Au-dsDNA的形成。在4.0×10-6～1.0×10-5mol/L内,检测灵敏度随MB浓度的增加而升高,当浓度达到2.0×10-5mol/L时接近最大值。示差脉冲伏安法检测结果表明,该检测体系对目标DNA的选择性识别能力高,可区分具有单碱基错配的目标DNA序列。检测体系对目标DNA的检测灵敏度随着目标DNA浓度的增加而增加,在5.0×10-10～1.8×10-9mol/L内呈线性关系,计算所得对目标DNA的检测限为5.0×10-10mol/L。使用寿命检测表明,经过5次变性/杂交循环后,检测信号降低并接近于检测限。