重组结核分枝杆菌11kDa蛋白皮肤试验与体外干扰素γ检测方法的比较

目的对重组结核分枝杆菌11k Da蛋白(以下简称重组11k Da蛋白)皮肤试验与体外干扰素γ(interferonγ,IFNγ)检测方法进行比较。方法选取32名健康志愿者进行重组11k Da蛋白和TB-PPD的同体双臂皮肤试验,分别于不同前臂皮内注射0.1 ml重组11k Da蛋白(10μg/ml)和0.1 ml TB-PPD(50 IU/ml),注射后24、48、72 h测量志愿者皮肤反应(硬结和红晕)的两个直径(最大径和最大径的垂直径),并取其均值。于皮肤试验前采集32名志愿者的静脉血,分离外周血单个核细胞,采用T-SPOT.TB试剂盒进行检测。比较重组11k Da蛋白皮肤试验与体外IFNγ检测结果的一致性。结果以注射72 h后的硬结反应统计重组11k Da蛋白皮肤试验中阳性人数为8名,阳性率为25%,TB-PPD皮肤试验中阳性人数为24名,阳性率为75%,其中强阳性人数为8名;体外IFNγ检测(T-SPOT.TB)阳性人数为7名,阳性率为22%。重组11k Da蛋白皮肤试验结果和体外IFNγ检测结果一致性良好(Fleiss Kappa值=0.913),这两种检测方法的阳性率远低于TB-PPD皮肤试验(Fleiss Kappa值=0.266)。结论重组11k Da蛋白皮肤试验的检测结果与体外IFNγ检测结果基本一致,有潜力成为结核分枝杆菌潜伏感染者的新筛查方法。     

重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10和11kDa蛋白的动物效力分析

目的 比较重组结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)ESAT6-CFP10(简称EC)和11kDa蛋白对Mtb感染豚鼠的皮试反应差异.方法 将Mtb H37Ra和卡介苗(BCG)分别致敏豚鼠5周后,每只豚鼠皮内分别注射0.25、0.5和1μg重组EC、11kDa蛋白及5 IU纯蛋白...     

以结核分枝杆菌38kD重组蛋白为抗原的血清学诊断

目的克隆表达结核分枝杆菌38kD抗原基因,并以此蛋白为抗原,进行分枝杆菌的血清学诊断。方法采用PCR自结核分枝杆菌基因组DNA中扩增38kD抗原基因,经测序鉴定正确后,克隆于pGEX-4T-2表达载体,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物,经ELISA检测其抗原的灵敏度与特异性。结果目的蛋白表达量约占菌体总蛋白量的28%,ELISA检测灵敏度为79.8%,特异性为99.0%。结论重组38kD抗原可用于结核分枝杆菌的诊断。     

结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌分泌蛋白指纹图谱的比较

目的比较结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分泌蛋白的指纹图谱,分析分泌蛋白表达的差异,为分枝杆菌的快速鉴别奠定基础。方法选取结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌标准菌株,培养后灭活,提取分泌蛋白,用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)检测菌株分泌蛋白的表达,Biomaker Wizard Software分析软件筛选差异蛋白。重复测定20次分枝杆菌分泌蛋白,评价SELDI-TOF-MS检测分枝杆菌分泌蛋白相对分子质量的重复性。结果AU芯片能捕获近30个分枝杆菌分泌蛋白峰,4个蛋白峰为分枝杆菌共有。与非结核分枝杆菌分泌蛋白指纹图谱比较,有1个蛋白峰为结核分枝杆菌所特有。SELDI-TOF-MS重复检测20次分枝杆菌分泌蛋白显示,同一蛋白峰的相对分子质量变异系数≤0.05%。结论结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌差异蛋白的发现,可能有助于分枝杆菌的鉴别。     

结核分枝杆菌热休克蛋白基因真核表达载体的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌热休克蛋白X(heat shock protein X,HspX)基因与EGFP融合基因的真核表达载体p EGFP-N1-HspX,并在小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7中表达。方法以结核分枝杆菌(H37Rv)基因组DNA为模板,PCR扩增HspX基因,定向插入至质粒p EGFP-N1的多克隆位点,经酶切及测序鉴定正确后,将质粒p EGFP-N1-HspX转染RAW264.7细胞,荧光显微镜下观察GFP的表达,Real-time PCR及Western blot法鉴定HspX基因的表达。结果质粒p EGFP-N1-HspX经酶切及测序鉴定,证明构建正确;质粒p EGFP-N1-HspX转染24 h后,荧光显微镜下可见GFP表达,表达的重组融合蛋白Flag-HspX相对分子质量约43 000;转染组细胞中HspX基因m RNA水平明显高于空载体组(P0.01)。结论成功构建了p EGFP-N1-HspX融合基因真核表达载体,并在RAW264.7细胞中获得表达。     

结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的原核表达及其表达条件的优化

目的原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuber-culosis,MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白(recombinant ESAT6-CFP10,rEC),并优化表达条件。方法以(GGGGS)3为linker将ESAT6和CFP10两个基因连接,合成rEC全基因,插入至载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-rEC,转化至感受态E. coli BL21(DE3),筛选优势菌株进行诱导表达,并对诱导温度(25、30、37℃)、诱导剂种类及浓度(0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1. 0 mmol/L IPTG及0. 5、1、5、10、15、20 g/L乳糖)、诱导时间(2、3、4、5、6 h)、诱导起始A600(0. 4、0. 6、0. 8、1. 0)进行优化。菌种经5 L发酵罐发酵培养后,采用亲和层析及离子交换层析纯化rEC融合蛋白,于-20℃分别储存0、2、4、6个月,12. 5%SDS-PAGE分析rEC融合蛋白,并对保存0、6月的样品进行HPLC-SEC分析。结果重组质粒pET-28a-rEC经双酶切及测序鉴定,构建正确。rEC融合蛋白最适...     

结核分枝杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6。方法将ESAT-6基因自pET-24b-ESAT-6质粒亚克隆至pGEX-3C载体中,构建重组表达质粒pGEX-ESAT-6,经酶切及测序鉴定正确后,分别转化大肠杆菌JM107和BL21(DE3),以不同浓度IPTG诱导表达,表达产物经GSH-Sepharose4 B亲和层析纯化。结果所构建的重组表达质粒pGEX-ESAT-6经酶切及测序鉴定正确;重组融合蛋白在大肠杆菌JM107中的表达量较高,可达菌体总蛋白的24.2%;最适IPTG诱导浓度为0.1mmol/L;纯化的目的蛋白纯度可达83.9%。结论已成功构建了重组表达质粒pGEX-ESAT-6,并在大肠杆菌JM107中高效表达,为结核分枝杆菌亚单位疫苗及核酸疫苗的研制提供了材料。     

结核分枝杆菌TB10.4与呼吸道合胞病毒F1蛋白的融合表达

目的在大肠杆菌中融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)TB10.4蛋白与呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白。方法从MTB标准菌株H37Rv全基因组中扩增TB10.4(N/X)和TB10.4(N/B)基因,分别插入原核表达载体pET-28a和pET-30a中,构建重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4(N/B)/pET-30a;从F/18T/DH5α菌株中扩增F1(B/X)基因,与TB10.4(N/B)/pET-30a质粒连接,构建重组表达质粒TB10.4-F1/pET-30a;将质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a分别转化感受态E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组TB10.4和TB10.4-F1蛋白相对分子质量约为13 000和59 000,可与鼠抗His单抗特异性结合。结论成功在大肠杆菌中表达了重组融合蛋白TB10.4-F1,为进一步研究其免疫原性及保护性奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv0674蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的在大肠埃希菌(E. coli)中表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)Rv0674蛋白,纯化后制备多克隆抗体,并检测抗体效价。方法用PCR技术从MTB H37Rv基因组中扩增Rv0674基因,克隆至p EASYBlunt E1表达载体后,转化入E. coli BL21(DE3)中,用优化后的IPTG诱导表达条件表达Rv0674蛋白,His trap TM HP亲和层析柱纯化目的蛋白;将纯化的蛋白腹腔注射BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA和Western blot法检测抗体效价及特异性。结果成功获得了Rv0674序列正确的重组质粒p EASY-E1-Rv0674,挑选出了高表达Rv0674基因的菌株,确定的最适表达条件为1. 0 mmol/L IPTG 28℃诱导表达8 h,获得了相对分子质量约26 500的可溶性蛋白;免疫BALB/c小鼠后,能刺激小鼠产生多克隆抗体,获得的抗血清具有良好的抗原结合特性,且效价大于1∶51 200。结论成功获得了高纯度的Rv0674蛋白,并首次制备出小鼠抗Rv0674蛋白的多克隆抗体,为进一步研究Rv0674蛋白的功能和临床诊断结核病(tuberculosis,TB)的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌H_(37)Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达

目的克隆并表达编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因。方法利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性。结果克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43000,诱导2h表达量较高,约为25%。目的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上。经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应。结论已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础。     

重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂糖凝胶层析柱纯化复性后,在体外对经5种不同类型的表达结核杆菌Ag85a和ESAT6的重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞进行刺激,以MTT法检测脾淋巴细胞的增殖反应。结果重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约41000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的55.65%;纯化复性的重组融合蛋白纯度达95%以上,表达量约为1.2g/L发酵液,且具有良好的反应原性;与空痘苗病毒或生理盐水免疫的小鼠相比,5种重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞与Ag85a-ESAT6融合蛋白共培养后,增殖活性明显升高(P<0.01)。结论成功利用原核系统表达了结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,纯化复性的Ag85a-ESAT6融合蛋白具有生物学活性。     

Mycobacterium tuberculosis Rv1916 is an Acetyl-CoA-Binding Protein

Isocitrate lyase (ICL) isoform 2 is an essential enzyme for some clinical Mycobacterium tuberculosis (Mtb) strains during infection. In the laboratory Mtb strain H37Rv, the icl2 gene encodes two distinct gene products – Rv1915 and Rv1916 – due to a frameshift mutation. This study aims to characterise these two gene products to understand their structure and function. While we were unable to produce Rv1915 recombinantly, soluble Rv1916 was obtained with sufficient yield for characterisation. Kinetic studies using UV-visible spectrophotometry and ¹H-NMR spectroscopy showed that recombinant Rv1916 does not possess isocitrate lyase activity, while waterLOGSY binding experiments demonstrated that it could bind acetyl-CoA. Finally, X-ray crystallography revealed structural similarities between Rv1916 and the C-terminal domain of ICL2. Considering the probable differences between full-length ICL2 and the gene products Rv1915 and Rv1916, care must be taken when using Mtb H37Rv as a model organism to study central carbon metabolism.     

结核分枝杆菌ESAT-6重组二聚体的表达、纯化及其在血清学诊断中的初步应用

目的表达和纯化结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6重组二聚体(rdESAT-6),并探讨其在结核病血清学诊断中的价值。方法以HG856A核酸疫苗质粒为模板,经PCR扩增获得2×esat-6基因,克隆至pET-28a质粒,构建原核表达质粒pET2E6;转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;用Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白,并用Western blot鉴定其反应原性,ELISA检测其敏感性和特异性。结果ESAT-6重组二聚体以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的35%;纯化的rdESAT-6纯度可达95%,可与ESAT-6小鼠抗血清发生特异性反应;用于结核病血清学诊断的敏感性为30%,特异性为95.8%。结论已成功表达并纯化了rdESAT-6,可作为结核病血清学诊断或皮试检测用的抗原之一。     

Reexamination of the Ergothioneine Biosynthetic Methyltransferase EgtD from Mycobacterium tuberculosis as a Protein Kinase Substrate

Ergothioneine has emerged as a crucial cytoprotectant in the pathogenic lifestyle of Mycobacterium tuberculosis. Production of this antioxidant from primary metabolites may be regulated by phosphorylation of Thr213 in the active site of the methyltransferase EgtD. The structure of mycobacterial EgtD suggests that this post-translational modification would require a large-scale change in conformation to make the active-site residue accessible to a protein kinase. In this report, we show that, under in vitro conditions, EgtD is not a substrate of protein kinase PknD.     

结核分枝杆菌融合蛋白亚单位疫苗对BCG初始免疫的加强效应及保护效力

目的探讨结核分枝杆菌融合蛋白亚单位疫苗对BCG初始免疫的加强效应及保护效力。方法将Ag85B、Ag85B-Mpt64190-198-HspX(AMH)、Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4(AMM)以及AMH+AMM蛋白分别与佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)和卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)混合,制备亚单位疫苗。第0周用BCG皮下免疫C57BL/6小鼠,第8、10周分别用各蛋白疫苗皮下加强免疫,以PBS和BCG(仅免疫1次)作为对照。末次免疫后4周,采血检测血清抗体水平,并分离脾淋巴细胞,检测分泌IFNγ的水平;末次免疫后12周,经尾静脉注射H37Rv株,6周后取肺,进行菌落计数,抗酸及HE染色观察。结果各亚单位疫苗加强组诱导产生的特异性抗Ag85BIgG抗体水平均明显高于BCG组;融合蛋白疫苗加强组免疫小鼠脾细胞经Ag85B和PPD刺激后,产生分泌IFNγ的淋巴细胞数明显多于BCG组;融合蛋白加强组免疫小鼠肺组织结核结节面积与BCG组比较,差异无统计学意义;仅AMM+AMH加强组免疫小鼠肺组织菌落计数明显低于BCG组,其抗酸染色阳性细菌数明显低于PBS、BCG及AMH、Ag85B加强组。结论AMH和AMM疫苗联合加强BCG免疫,能诱导小鼠特异性的细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性,可增强BCG的保护效力。     

结核分枝杆菌复活促进因子E的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌复活促进因子E(RpfE)的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfE基因,双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a(+)载体连接,转化大肠杆菌Top10。阳性克隆经酶切和DNA测序鉴定正确后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达RpfE蛋白,并对表达蛋白进行鉴定和纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预期相符,测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,在相对分子质量41000处均可见特异性蛋白条带。经Ni2+-NTA金属螯合层析后,重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功地克隆并构建了RpfE基因的重组表达质粒pET32a(+)-RpfEv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。