水产品中副溶血性弧菌实时荧光PCR检测方法

建立了一种特异、灵敏、稳定的副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)致病基因的检测方法。对已建立的副溶血性弧菌致病基因tdh、trh和tlh荧光PCR方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测,以验证该方法的有效性。该方法与副溶血性弧菌反应良好,与其他弧菌属和非弧菌属的6株常见食源性致病菌无交叉反应;检测了6株副溶血性弧菌标准菌株和分离株,3种致病基因检出限分别为tlh 6～43 CFU/mL,tdh 97～1 700 CFU/mL,trh 1 100～4 000 CFU/mL;3种致病基因20次重复组内变异系数在0.96%～1.50%,组间变异系数在2.70%～4.10%。该方法操作简便,特异性强,灵敏度高,能够准确、快速、灵敏地检测水产品中副溶血性弧菌。     

荧光PCR检测副溶血性弧菌致病性方法的建立

目的 建立一种准确、快速、特异地检测副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）致病基因的荧光PCR方法。方法 用7株已知其致病基因的VP标准菌株和检出菌分别对6种VP致病基因荧光PCR检测文献方法和本文建立的方法进行验证比较,并用6种常见食源性病原菌对新建方法的特异性进行检验。结果 所建方法能够同时检测VP的3种溶血素,其检测结果与菌株的溯源结果及普通PCR结果完全一致,且与常见食源性病原菌无交叉反应。结论 本文建立的荧光PCR体系能够准确、快速、特异地检测VP的致病基因,具有较好的实用性。     

冷冻水产品中副溶血性弧菌的实时荧光PCR检测方法研究

文章研发了一种可在16 h内完成冷冻水产品中副溶血性弧菌快速检测的方法。方法在首先完成样品的预增菌工作后,采用高温热裂解法与核酸亲和膜吸附法提取冷冻水产品等样品中的检材总DNA,设计副溶血性弧菌专一引物探针,运用实时荧光定量PCR技术扩增试样中副溶血性弧菌基因组保守基因片段,同时开展与国家标准方法的比对工作证实方法的可靠性,建立了特异性好、高检测通量的PCR检测方法。为验证所建立方法的适用性与稳定性,本研究从市场中随机抽取共331份冷冻水产品样品开展副溶血性弧菌的筛查检测,结果表明采用该方法在上述抽样调查的冷冻水产品中3份样品的副溶血性弧菌特异性的基因片段被扩增检验出,试样的目标菌检出率约为0.9%(3/331),该研究PCR方法的DNA检出限可达到0.01 ng/μL。     

荧光PCR检测副溶血性弧菌致病基因方法的建立

建立一种准确、快速、特异地检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)致病基因的荧光PCR方法。方法 用7株已知其致病基因的VP标准菌株和检出菌分别对6种VP致病基因荧光PCR检测文献方法和本文建立的方法进行验证比较,并用6种常见食源性病原菌对新建方法的特异性进行检验。结果 所建方法能够同时检测VP的3种溶血素,其检测结果与菌株的溯源结果及普通PCR结果完全一致,且与常见食源性病原菌无交叉反应。结论 本文建立的荧光PCR体系能够准确、快速、特异地检测VP的致病基因,具有较好的实用性。     

副溶血性弧菌实时荧光定量PCR标准模板的构建和检测方法的建立

目的:构建肉制品副溶血性弧菌实时荧光定量PCR的标准阳性模板和检测方法.方法:以副溶血性弧菌toxR基因上特异性片段为目标,设计并合成引物及Taqman探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性.结果:构建出副溶血性弧菌荧光定量PCR检测方法的标准模板并建立了相应的检测方法,获得的标准曲线方程为:Y=-3.151 lgX+42.86,灵敏度40copies/反应体系,对副溶血性弧菌具有特异性,同时,该方法具有良好的重复性,变异系数小于5％.结论:使用基于Taqman探针技术的荧光定量PCR检测方法能够对食品中致病性副溶血性弧菌进行快速、简便、准确、高效的定量检测.     

双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌毒力基因方法的建立和应用

目的 建立一种同时检测副溶血性弧菌两种毒力基因tdh和trh的双重荧光聚合酶链式反应(PCR)方法,并对我国2 771株食源性副溶血性弧菌携带的毒力基因进行全面检测.方法 针对副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因分别设计荧光PCR引物和探针,优化荧光PCR反应体系及反应程序,建立可同时检测两种毒力基因的双重荧光PCR检测...     

基于内参的副溶血性弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立基于内参的副溶血性弧菌实时荧光定量PCR方法,快速检测样品中的副溶血性弧菌。方法根据Gen Bank已公布的副溶血性弧菌基因组序列,筛选特异性靶基因,设计特异性引物探针,优化反应体系,并在体系中加入内参(IAC),通过标记不同荧光基团的Taq Man探针来监测IAC,进而实时监控整个PCR反应。按照5~50 cfu/25 g的细菌量人工污染样品,以评价所建立反应的体系。结果以副溶血性弧菌基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/μl;以10倍梯度稀释的菌液经水煮法提取的DNA为模板,最低检测限为4×102cfu/ml;以含有gyr B的质粒为模板,最低检测极限可以达到100 copies/μl;建立gyr B和gyr B-IAC标准曲线,Ct值与模板拷贝数均呈良好线性关系(r2=0.999);人工污染初始菌量为7 cfu/25 g时,样品中副溶血性弧菌增菌6 h即可检出。结论本研究所建立的gyr B-IAC实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中副溶血性弧菌,又能实时监测PCR反应过程,有效防止"假阴性"的发生,结果可靠,有利于实现海产品中副溶血性弧菌实时荧光定量PCR检测方法的标准化。     

MALDI-TOF-MS方法检测、鉴定副溶血性弧菌

目的 应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术建立快速检测和鉴定副溶血性弧菌的方法。方法 采用副溶血性弧菌标准菌株,在不同的培养基或不同的培养时间进行MALDI-TOF-MS检测,同时对长时间冷冻保存的菌株进行检测,以验证该方法的稳定性和重复性。对不同来源的菌株进行检测,以确认方法的准确性。结果 用PW、TCBS琼脂和弧菌显色培养基等3种培养基,以及分别培养18 h、42 h和72 h的细菌,对该菌的蛋白质谱图影响很小;保存2年的菌株,其MALDI-TOF-MS鉴定分值保持稳定;对来自不同国家和地区的不同来源的菌株都可以得到同样准确的结果。结论 MALDI-TOF-MS方法可以快速、准确地鉴定副溶血性弧菌。因其具有很好的稳定性和重复性,可用于副溶血性弧菌的日常检测。     

恒温实时荧光法检测副溶血性弧菌

为了更加准确、快速地检测进出口食品中的副溶血性弧菌,针对副溶血性弧菌的tlh基因设计环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)引物,结合ESEQuant tube scanner来对扩增结果进行实时检测。结果显示:该引物扩增效率高、特异性强、灵敏度高(1-10 CFU/反应,约为荧光PCR的100倍)。126株副溶血性弧菌,恒温荧光法检测出126株,荧光PCR的方法检测出121株。恒温实时荧光检测仪与荧光PCR仪类似,均可以对检测结果进行实时监测和熔解曲线分析,表明该恒温实时荧光检测仪可广泛应用于基础实验室的科学研究或经济发展相对落后区域的临床初步诊断。     

高分辨率熔解曲线分析法检测食源性副溶血性弧菌

为建立一种快速鉴定副溶血性弧茵的HRM（高分辨率熔解曲线）real-timePCR法,以toxR为靶基因,结合特异性引物,通过优化反应体系及条件,进行特异性、敏感性及重复性评价,并初步应用于90份送检的鲜活海产品样本的检测。特异性试睑表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,Tm值为76．64±0．57℃;而与创伤弧菌、霍乱弧茵、金黄色葡萄球菌等多种海产品中常见的食源性病原菌没有交叉反应。灵敏度试验表明,该方法最少可检测toxR重组质粒的浓度为3．50×102copies／mL。重复性试验表明,同一样品于试验内及试验问的平均Tm值分别为76．53±0．35℃和76．74±0．52℃,变异系数分别为0．56±0．42％和1．11±0．73％。对90份鲜活海产品样本的检测证实该法可使阳性检出率从国标法的14．44%高至18．89％。本研究所建立的副溶血性弧菌HRMreal-ILrnePCR法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能应用于食品样本的检测,具有很好的研究价值和应用前景。     

转基因番木瓜及其深加工制品的PCR检测方法

对番木瓜不同材料及其深加工制品的核酸提取方法进行了优化。成功提取出DNA。选取番木瓜特异性的内源蛋白PAPAIN基因片段作为内参基因，用于检验提取DNA的质量，有效避免了聚合酶链式反应PCR的假阴性并能用于确定检测样品中是否含有番木瓜成分。选取国内目前应用比较多的外源目的基因环斑病毒外壳蛋白（CP）基因以及复制酶（RP）基因作为品系鉴定的基因。适用于出入境检验检疫部门和农业部门对转基因番木瓜及其制品的检验监测。     

茶多糖提取工艺研究

采用单因素分析优化茶多糖（TSP）提取参数，正交设计确定最佳提取条件，研究浸提温度、浸提时间、料液比对TSP得率、茶多糖含量及蛋白质含量的影响。对TSP含量和蛋白质含量进行相关性分析。浸提温度宜在55℃，浸提时间宜为3h，料液比达到1：25即可。对TSP得率影响最大的为因素时间，其次为料液比和浸提温度。TSP的最佳提取条件为，浸提温度55℃，浸提时间3h，料液比（RTW）1：25。TSP含量和蛋白质含量的相关性分析表明两者具有正相关性。     

尿素包合法纯化共轭亚油酸条件的优化研究

采用尿素包合法对纯度在70％的共轭亚油酸（CLA）进行了提纯研究。共轭亚油酸在甲醇与尿素形成的体系中70℃加热回流2h，其中的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸与尿素形成复合物析出，从而可以使共轭亚油酸得到纯化。研究发现，尿素包合共轭亚油酸的最佳工艺条件为：共轭亚油酸，尿素／甲醇=1：2．5：8，包合温度为-15℃，包合时间为6h，得到的共轭亚油酸经过三氟化硼-甲醇溶液衍生化后，用气相色谱进行检测纯度可达93，6％，基本实现了共轭亚油酸的分离纯化。     

葡萄糖酸钠检测方法研究

介绍了4种常用的葡萄糖酸钠检测方法：HPLC法、分光光度法、非水滴定法和旋光法。其中HPLC法和非水滴定法简便且具有较好的实用性，可用于检测工业生产的葡萄糖酸钠。     

抗草甘膦转基因大豆加工品的PCR检测研究

以进口抗草甘膦转基因豆粕、豆粉和中国脱脂大豆为材料,利用设计的特殊引物,建立了PCR技术定性检测抗草甘膦转基因大豆加工品的方法,成功检测出进口抗草甘膦转基因豆粕和豆粉的内源参照基因Lectin、CaMV35S/CTP of EPSPS边界序列和NOS终止子,国产脱脂大豆仅检出内源参照基因Lectin,确定了此PCR技术检测抗草甘膦转基因大豆的灵敏度为0.1%,稳定性良好.     

A SIMPLE,RAPID METHOD FOR THE DETECTION OF SUBSPECIES OF ZYMOMONAS MOBILIS

Zymomonas strains are simply and rapidly detected after growth in a selective liquid medium by the addition of a Schiff's reagent. This dye reacts with acetaldehyde produced by Zymomonas to give a deep purple colour. The optimal conditions for the test are evaluated and it is shown to be specific for Zymomonas strains. The use of the dye reaction in routine microbiological quality control is described. A comparison is presented of the dye test and the use of an agar medium containing sulphite and lead acetate on which Zymomonas strains which produce H₂S form characteristic colonies.     

番茄红素的提取工艺研究

为了更为经济有效地提取番茄红素,研究了预处理方法、溶剂的选择、液料比、pH值等条件对番茄红素提取率的影响。结果表明最佳提取条件为：离心脱水,溶剂为丙酮：正己烷为2：1,料液比为1：6,pH为6。其中离心脱水可以极大地提高番茄红素的提取率。     

食品中热损伤沙门氏菌选择性增菌及实时荧光聚合酶链式反应检测

为了能够高效检测食品中的亚致死损伤沙门氏菌,首先采用热激胁迫的方法得到亚致死损伤沙门氏菌细胞,进而基于选择性增菌培养液SEL建立一种实时荧光聚合酶链式反应检测技术。结果表明：在SEL中经过20h增菌培养后,无论是否经过修复培养,1～2CFU/5mL SEL的亚致死损伤细胞都能得到完全修复并增菌至109CFU/mL水平;依此建立的实时荧光聚合酶链式反应检测技术的纯菌扩增效率为95.41%,检测限为4CFU/反应体系,在人工污染碎食品样品中的检测限为3CFU/10g碎牛肉,而且与传统培养检测方法的结果相吻合。本方法在24h内即可完成食品中热损伤沙门氏菌的修复、选择性增菌以及实时荧光聚合酶链式反应检测,可应用于食品中沙门氏菌污染状况调查及高效检测。