RACE技术对薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA 3'末端的快速扩增

对微生物Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA 3'末端的序列进行了调取.根据薯蓣皂苷糖苷酶基因的CDS区已知序列设计特异性引物,应用3'RACE(Rapid-Amplification of eDNA 3'Ends)技术,快速扩增得到cDNA 3'端未知序列片段,将PCR产物切胶回收,直接测序得到长度为258 bp的产物序列,经比对其中编码区长度为122 bp,非编码区长度为136 bp,Poly A部分长度为28 bp.这对其他类中草药高活性皂苷糖基水解酶基因cDNA3'末端的序列的调取提供了参考.     

真菌产人参皂苷葡萄糖苷酶基因的调取

根据已知的人参皂苷糖苷酶(GluGF)的N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidia Sp.R84g菌株的总RNA出发,应用RACE技术,快速扩增测序得到cDNA3′末端与cDNA5′末端的未知序列,利用扩增测序所得到的cDNA5′末端和cDNA3′末端的序列设计引物,进行二次RT-PCR扩增并测序得到GluGF基因的全序列。回收PCR产物测序,得到GluGF基因的序列全长为2149 bp,其中5′UTR长度为82 bp,3′UTR长度为114 bp,GluGF的CDS区序列全长为1 923 bp,所编码的氨基酸序列的长度为640个氨基酸。     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的cDNA 5′末端的快速扩增

根据人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的CDS区已知序列设计引物,应用"去帽法"原理快速扩增出了人参皂苷-α-鼠李糖苷酶cDNA 5′端未知序列.测序结果表明,扩增出的5′端未知序列长度为421 bp.通过与已知的CDS区序列比对,确定扩增出的5′端未知序列就是目的序列,其5′端非编码区长度为61 bp.     

真菌产人参皂苷葡萄糖苷酶基因的调取

根据已知的人参皂苷糖苷酶(GluGF)的N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidia Sp.R84g菌株的总RNA出发,应用RACE技术,快速扩增测序得到cDNA3′末端与cDNA5′末端的未知序列,利用扩增测序所得到的cDNA5′末端和cDNA3′末端的序列设计引物,进行二次RT-PCR扩增并测序得到GluGF基因的...     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的cDNA5’末端的快速扩增

根据人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的CDS区已知序列设计引物，应用“去帽法”原理快速扩增出了人参皂苷-α-鼠李糖苷酶cDNA5’端未知序列．测序结果表明，扩增出的5’端未知序列长度为421bp．通过与已知的CDS区序列比对，确定扩增出的5＇端未知序列就是目的序列，其5’端非编码区长度为61bp．     

利用SMART RACE克隆STGA3 cDNA的5′末端

阐述了SMART RACE的原理,克隆了草莓贝壳杉烯氧化酶基因(STGA3)5′端未知序列。所得到的STGA3 cDNA的5′末端共有1 474 bp,其中非编码区共34 bp,编码区1 440 bp,编码氨基酸480个,此序列在NCBI的注册号为:AY462247。它与已克隆到的同源基因拟南芥GA3和南瓜CYPT01A1之间的同源性分别为56.9%和59.2%。     

利用SMART RACE克隆STGA3 cDNA的5'末端

阐述了SMART RACE的原理,克隆了草莓贝壳杉烯氧化酶基因（STGA3）5’端未知序列。所得到的STGA3 cDNA的5’末端共有1474bp,其中非编码区共34bp,编码区1440bp,编码氨基酸480个,此序列在NCBI的注册号为：AY462247。它与已克隆到的同源基因拟南芥GA3和南瓜CYPT 01A1之间的同源性分别为56．9％和59．2%。     

哈茨木霉丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆表达

为深入研究丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的功能,从哈茨木霉cDNA文库中克隆丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2A)基因,并成功构建到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在40.5kDa处出现特异性条带.在22℃以0.5mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白大部分以可溶形式存在,在37℃以1.0mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白则大部分以包涵体存在.全长cDNA序列为1286bp,5′非编码区91bp、3′非编码区237bp,编码327个氨基酸,没有信号肽.本研究为PP2A基因的功能验证奠定基础,以便进一步研究蛋白磷酸酶的功能,从而获得更多关于哈茨木霉蛋白磷酸酶作用机制的信息.     

家蚕znfhit基因的克隆表达及序列分析

在对家蚕蛹 cDNA文库的测序中发现了znfhit(zinc finger HIT)的 EST序列(GenBank登录号 DY230769).经过比对发现znfhit全长为1019bp,由297bp的 5'端非编码区序列(5'UTR)、462bp的开放读码框(ORF)和260bp的3'端非编码区序列(3'UTR)组成.将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,此基因由3个外显子和2个内含子组成.ZNFHIT蛋白的疏水性最大值为1.533,最小值为-3.267,且不含跨膜区域.用PCR方法扩增获得znfhit基因,将其克隆至质粒pET-28a上,构建重组质粒pET-znfhit,并在大肠杆菌中大量表达,经镍离子亲和层析纯化得到重组蛋白,质谱鉴定其分子量为21.11KD,为后续研究其功能提供了条件.     

穿山龙薯蓣皂苷酶解产物的分离纯化

用柱层析法分离纯化穿山龙薯蓣皂苷的酶解产物,硅胶柱中的流动相为氯仿与甲醇的不同比例,经硅胶柱分离得到薯蓣皂苷酶解产物的两种单体,为产物Ⅰ和产物Ⅱ,用薄层层析法和高效液相色谱法检测,得到产物Ⅰ为3-(O)-(-βD-吡喃葡萄糖基)-薯蓣皂苷元,得率为17.85%,纯度为69.41%。同时得到产物Ⅱ,得率为1.64%。产物2为反应副产物,其结构、性质及药理作用有待于进一步研究。     

人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析

为了获得一种具有生物学活性的小分子多肽基因人α 防御素HNP 1,提取人外周静脉血液总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到长度约为380bp的防御素(De fensin)基因片段,并将该扩增产物连接入pMD18 T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,对PCR鉴定含有目的片段的克隆进行核苷酸序列测定,获得α 防御素HNP 1基因克隆。用序列处理在线工具包分析HNP 1基因结构。     

人参皂甙β-糖苷酶的基因结构

为了研究人参皂甙 β 糖苷酶的基因结构 ,根据人参皂甙 β 糖苷酶的氨基酸N 末端序列设计了RT PCR引物 ,应用氯化铯密度梯度离心法提取了菌体总RNA ,以JFX0 1为模板进行RT PCR反应得到一条 1.0kb的基因 ,并对该基因进行了克隆测序。该测序结果与已知蛋白的基因无同源性 ,说明所得到的人参皂甙 β 糖苷酶的基因很有可能是新的基因     

穿山龙薯蓣皂苷酶解产物的分离纯化

用柱层析法分离纯化穿山龙薯蓣皂苷的酶解产物,硅胶柱中的流动相为氯仿与甲醇的不同比例,经硅胶柱分离得到薯蓣皂苷酶解产物的两种单体,为产物Ⅰ和产物Ⅱ,用薄层层析法和高效液相色谱法检测,得到产物Ⅰ为3-（O） -（β-D-吡喃葡萄糖基） -薯蓣皂苷元,得率为17.85%,纯度为69.41%.同时得到产物Ⅱ,得率为1.64%.产物2为反应副产物,其结构、性质及药理作用有待于进一步研究.     

人参皂甙β—糖苷酶的基因结构

为了研究人参皂甙β-糖苷酶的基因结构,根据人参皂甙β-糖苷酶的氨基酸N-末端序列设计了RT-PCR引物,应用氯化铯密度梯度离心法提取了菌体总RNA,以JFA01为模板进行RT-PCR反应得到一条1.0kb的基因,并对该基因进行了克隆测序,该测序结果与已知蛋白的基因无同源性,说明所得到的人参皂甙β-糖苷酶的基因很有可能是新的基因。     

穿山龙薯蓣皂苷酶解产物的分离纯化

用柱层析法对穿山龙薯蓣皂苷酶解产物进行分离纯化(硅胶柱中以氯仿甲醇洗脱),得到2种单体皂苷和皂苷元。经薄层层析检测,纯化的单体皂苷1为3 (O) (β D 吡喃葡萄糖基) 薯蓣皂苷,得率为样品的33.95%,用高效液相色谱法检测其纯度为93.82%。产物2的结构和特征有待进一步研究。     

人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析

为了获得一种具有生物学活性的小分子多肽基因人α-防御素HNP-1，提取人外周静脉血液总RNA，反转录为cDNA作为模板，采用PCR的方法扩增得到长度约为380bp的防御素(Defensin)基因片段，并将该扩增产物连接入pMD18-T载体，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，对PCR鉴定含有目的片段的克隆进行核苷酸序列测定，获得α-防御素HNP-1基因克隆。用序列处理在线工具包分析HNP-1基因结构。     

海刺参组织蛋白酶L基因的克隆、重组表达及活性鉴定

通过RT-PCR和RACE PCR技术,从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到编码组织蛋白酶L(SjCL)基因,其中全长cDNA 1 287 bp,5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR 87 bp,开放阅读框(ORF)999 bp,编码332个氨基酸(aa),包括组织蛋白酶L成熟肽316 aa和信号肽16 aa,分子质量预测为35.3 ku。用SjCL序列与相似物种海胆、海葵等进行对比,可知SjCL具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守区域ERFNIN和GNFD,以及由Cys 139,His 278和Asn 299残基组成的保守活性位点。将编码SjCL基因克隆进原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-SjCL,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,再进行诱导表达、亲和纯化和透析复性,得到了纯化且具有活性的重组SjCL。酶活力检测结果表明,重组SjCL对组织蛋白酶L特异性底物Z-Phe-Arg-Nmec具有较高活性,而对组织蛋白酶B特异性底物Z-Arg-Arg-Nmec无活性。本实验对SjCL的cDNA序列进行了生物信息学分析并通过基因工程的手段表达出具有活性的重组SjCL,为进一步研究组织蛋白酶L在海刺参自溶过程中的作用提供理论基础。     

海刺参组织蛋白酶L基因的克隆、重组表达及活性鉴定

通过RT-PCR和RACE PCR技术,从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到编码组织蛋白酶L(SjCL)基因,其中全长cDNA 1 287 bp,5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR 87 bp,开放阅读框(ORF)999 bp,编码332个氨基酸(aa),包括组织蛋白酶L成熟肽316 aa和信号肽16 aa,分子质量预测为35.3 ku。用SjCL序列与相似物种海胆、海葵等进行对比,可知SjCL具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守区域ERFNIN和GNFD,以及由Cys 139,His 278和Asn 299残基组成的保守活性位点。将编码SjCL基因克隆进原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-SjCL,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,再进行诱导表达、亲和纯化和透析复性,得到了纯化且具有活性的重组SjCL。酶活力检测结果表明,重组SjCL对组织蛋白酶L特异性底物Z-Phe-Arg-Nmec具有较高活性,而对组织蛋白酶B特异性底物Z-Arg-Arg-Nmec无活性。本实验对SjCL的cDNA序列进行了生物信息学分析并通过基因工程...     

发酵产薯蓣皂苷酶的反应条件

研究了酶法水解黄姜薯蓣皂苷分子上的糖基,使皂苷水解生成无糖基、高活性皂苷元的条件。探讨了4种菌株对薯蓣皂苷糖基的水解能力,筛选出1种薯蓣皂苷酶高产菌株Absidia sp.s00,用于水解薯蓣皂苷。通过薄层层析法分析得到薯蓣皂苷酶解最佳反应条件为40℃p、H 5.0,反应30 h。在此最佳条件下进行酶反应,1 g黄姜薯蓣皂苷底物水解后,酶解产物经分离纯化,得薯蓣皂苷元0.1 g,采用高效液相色谱检测其纯度为90%以上。     

细菌发酵产黄姜薯蓣皂苷元的分离纯化

黄姜经细菌发酵水解其薯蓣皂苷糖基,产物皂苷用正丁醇萃取法收集;采用经硅胶柱层析法分离纯化转化的皂苷,得到两种转化的单体皂苷产物Ⅰ和产物Ⅱ。采用薄层层析法及高效液相色谱法进行检测,得知产物Ⅰ为目的产物薯蓣皂苷元,得率为20%,纯度为96.9%,产物Ⅱ的结构和特征有待进一步研究。