关于预防性疫苗异常毒性检测的几点思考

正通常含预防性疫苗在内的所有人用生物制品在灌装后的终产品阶段均需通过一项毒性或安全性检测[1],即异常毒性检测。这项检测最早在20世纪初(1900s)开始发展作为确保血液制品生产安全性及一致性的手段,之后拓展为用于所有生物制品检测外源污染物的一般化安全性检测。异常毒性检测曾一度为世界卫生组织技术指南(WHO Recommendations and Guidelines)及各国国家药典(National Pharmacopoeias)所推行[2]。但近年来随着疫苗研发、生产及质控等水平提高和产业升级,人们对异常毒性检测的意义、要求、方式、操作等各方面提出了疑问。     

疫苗异常毒性检查及相关问题探讨

正异常毒性检查一直是疫苗质量控制中涉及安全性的批放行检查项目,主要检查疫苗在生产过程中可能引入的外来污染物或疫苗成分降解在动物体内产生的非正常或毒性反应。目前,WHO或部分国家/地区药典标准对疫苗异常毒性检查进行了修订,引起国内外疫苗行业的广泛关注。本文就国内外异常毒性检查的建立及发展历程进行总结,并对     

乙脑风疹联合减毒活疫苗病毒间的相容性

目的研究乙脑风疹联合减毒活疫苗中乙脑病毒和风疹病毒的相容性。方法将乙脑病毒SA14-14-2疫苗株制备的乙脑减毒活疫苗原液与风疹病毒RA27/3疫苗株制备的风疹减毒活疫苗原液按体积比1∶1比例混合,加入保护剂,冻干制成乙脑风疹联合减毒活疫苗。采用BHK21细胞蚀斑法测定联合疫苗中的乙脑病毒滴度,细胞病变法检测风疹病毒滴度;通过鉴别试验、热稳定性试验、乙脑疫苗免疫原性试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验以及基因稳定性分析观察联合疫苗病毒间的相容性。结果联合疫苗的乙脑和风疹病毒滴度与单价疫苗的病毒滴度变化在检测误差的允许范围内;联合疫苗于37℃放置7 d,与放置前相比,风疹病毒和乙脑病毒的滴度值下降分别小于1.0 LgCCID50/ml和1.0 LgPFU/ml,符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗中的风疹疫苗对乙脑疫苗的免疫原性无明显的干扰效应;鉴别试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗在BHK21细胞上传代5次后,乙脑和风疹病毒基因序列均未发生变化。结论乙脑风疹联合减毒活疫苗中的乙脑和风疹病毒具有较好的相容性,本实验为乙脑风疹联合疫苗的进一步研制奠定了基础。     

重组乙型肝炎疫苗工艺中去除甲醛添加的探讨

目的通过比较甲醛处理前后重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和疫苗(汉逊酵母)成品各项检测指标及稳定性的变化,评估甲醛在重组乙型肝炎疫苗工艺中的作用,为重组乙型肝炎疫苗工艺中是否可取消甲醛处理步骤提供参考。方法采用扫描电镜观察、HPLC检测和疫苗体内效力评价指标半数有效剂量(ED_(50))、乙肝疫苗常规检测项目比较甲醛处理前后HBsAg及疫苗成品的变化情况,通过稳定性考察确定甲醛对疫苗稳定性和有效期的影响。结果 HBsAg经甲醛处理后产生轻微聚合,但疫苗成品ED_(50)和其他各项检测指标均无明显变化,动物异常毒性合格。甲醛处理和未处理疫苗成品的稳定性考察结果相同。结论重组乙型肝炎疫苗生产工艺中甲醛处理步骤对疫苗成品检测指标及稳定性无影响,可考虑取消,从而提高乙肝疫苗的质量和安全性。     

新型抗胃泌素疫苗的初步质量分析

目的分析一种新型抗胃泌素(gastrins,GAS)疫苗的质量,为其质量标准的建立提供参考。方法采用免疫双扩散法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)对一种将GAS抗原表位与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)载体偶联的新型抗GAS疫苗GAS-TT进行鉴定,并参考《中国药典》四部(2015版)对疫苗进行细菌内毒素、异常毒性及过敏反应检查。结果疫苗可特异性结合破伤风抗毒素及相应抗原表位抗体,其主成分相对分子质量为158 000～166 000,疫苗细菌内毒素含量为95 EU/mg,且无异常毒性及过敏反应。结论该疫苗具有较好的特异性结合属性及分子分布特征,且符合其相关安全性检查项(内毒素、异常毒性及过敏反应检查)的拟定标准。     

流感亚单位疫苗裂解剂残留量检测及安全性试验

目的检测流感亚单位疫苗的裂解剂残留量,并观察其安全性。方法制备3批流感亚单位疫苗,采用比色法检测其裂解剂Tween-80和CTAB的残留量,通过动物实验观察其安全性。结果制备的3批疫苗样品,Tween-80的残留量平均在68.3~72.0μg/ml之间,CTAB残留量平均在36.3~38.7μg/ml之间。在安全性试验中,豚鼠未出现过敏反应,小鼠和豚鼠未出现异常毒性反应。结论制备的流感亚单位疫苗的裂解剂残留量符合拟定规程要求,安全性良好。     

LT70-DPC结核亚单位疫苗安全性的初步评价

目的初步评价以阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵(dimo-thylidioctyl ammonium bro-mide,DDA)、聚肌胞苷酸(Poly I∶C)及胆固醇复合佐剂(简称为DPC)为佐剂的结核融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64(190-198)-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)亚单位疫苗的安全性。方法急性毒性试验:分别将低剂量与高剂量(分别相当于人用剂量的10 000和40 000倍)的LT70-DPC结核亚单位疫苗经皮下、腹腔两种途径免疫小鼠,观察小鼠毒性反应、死亡情况及体重变化等,同时推算小鼠对LT70-DPC亚单位疫苗的最大耐受剂量(maximum tolerated dose,MTD);异常毒性试验:将小鼠和豚鼠分别经腹腔注射LT70-DPC结核亚单位疫苗,观察动物异常反应、死亡情况及体重变化等;全身过敏试验:豚鼠经LT70-DPC结核亚单位疫苗免疫后,经相应疫苗静脉攻击,观察豚鼠过敏反应。结果急性毒性试验:皮下及腹腔注射后14 d内均未见小鼠的异常反应和死亡,体重均增加,小鼠对该疫苗的MTD为:LT70蛋白6 600μg/kg,DDA166 600μg/kg,Poly I∶C33 200μg/kg,胆固醇50 600μg/kg;异常毒性试验:注射后7 d内,小鼠及豚鼠全部健存,均未出现异常症状,体重增加;全身过敏试验:攻击后1 h内,豚鼠均未出现过敏反应。结论 LT70-DPC结核亚单位疫苗具有良好的安全性。     

森林脑炎纯化疫苗实验室检定及人体Ⅰ期临床观察

目的　进行森林脑炎纯化疫苗实验室检定、人体反应及血清学效果观察。方法　按 2 0 0 0年版《中国生物制品规程》要求对森林脑炎纯化疫苗进行全面的实验室检定 ,并按国家药品监督管理局临床研究批件的要求进行Ⅰ期临床观察。结果　疫苗经异常毒性试验、热原质试验、致敏性试验及有害物质检查均合格 ;并具有很好的免疫原性 ,小白鼠的免疫保护指数大于 5 0× 10 5。 2 0名志愿者接种疫苗后无一例出现局部反应和全身反应 ,且血清中和抗体全部阳转。结论　森林脑炎纯化疫苗安全性可靠 ,可继续进行Ⅱ Ⅲ期临床观察。     

人用狂犬病毒脂质体疫苗的制备及性质

目的制备人用狂犬病毒脂质体疫苗,并考察其制剂学及毒理学性质。方法以氢化大豆磷脂、胆固醇、十八胺为原料,采用反相蒸发法(REV)制备脂质体,加入纯化狂犬病毒抗原,以冻干重建法(DRV)制备狂犬病毒脂质体疫苗。在电镜下观察其形态,测定其包封率和体外释放率,用激光衍射粒度分析仪测定其粒径分布及平均粒径,并进行局部刺激性、过敏反应及异常毒性试验。结果所制备的狂犬病毒脂质体疫苗形态呈圆形或椭圆形,粒径分布均匀,平均粒径为12.25μm左右,包封率在60%以上。无刺激性,无异常毒性,过敏反应检测合格。结论所制备的狂犬病毒脂质体疫苗性质稳定,可作进一步研究。     

应用CHO细胞法检测百日咳疫苗中的残余毒性

根据百日咳毒素（PT）能特异地使中华地鼠卵巢细胞（CHO）聚集的性质，采用CHO细胞分析法检测了18批全细胞百白破疫苗（DTPw）和12批无细胞百白破疫苗（DTPa）。存放于4℃的两种疫苗中，DTPw聚集CHO细胞滴度的几何均值（GMT）是30.79±2．316,DTPa不产生聚集、两种疫苗在37℃存放4周后，DTPw聚集滴度的GMT是948．09±1．598．DTPa是205．67±1．392。实验结果表明，百日咳疫苗存在明显的毒性逆转现象，与动物试验不一致。因此建议采用CHO方法检测百日咳疫苗中PT的毒性。     

皮卡佐剂和皮卡狂犬病疫苗的安全性

皮卡(PICKCa)即聚肌胞注射液,是一种安全、有效的干扰素诱生剂。以皮卡为佐剂制成的皮卡狂犬病疫苗,其安全性不仅符合《中国药典》要求,而且其毒性、抗原含量和防腐剂含量均低于现行人用狂犬病疫苗。本文就皮卡佐剂及皮卡狂犬病疫苗的安全性作一综述。     

壳聚糖季铵盐微球作为注射疫苗佐剂的安全性评价

以小鼠、大鼠、豚鼠、家兔等为动物模型,对壳聚糖季铵盐微球作为注射疫苗佐剂进行安全性评价. 结果表明,小鼠急性毒性实验中50倍临床拟给药剂量(5.0 mg/只)下动物耐受性良好;大鼠重复毒性实验中即使50倍高剂量多次注射微球,动物各组织器官仍无病理性变化;异常毒性实验中小鼠给药后体征正常、体重明显增加,壳聚糖微球注射豚鼠后未见过敏反应及症状;家兔注射部位未发生肌肉组织溃烂、化脓等,佐剂未引起红细胞溶血.     

无细胞百日咳疫苗毒性体外检测方法的建立

目的建立无细胞百日咳疫苗毒性体外检测方法。方法依据活性PT的ADP核糖基化酶活性,设计并合成一段荧光标记的合成肽Gαi3C20,以其为底物,采用柱前衍生-HPLC法检测无细胞百日咳疫苗的毒性,并对建立的方法进行验证。结果该方法的最低检测限为1 ng;最低定量检测限为8 ng,线性范围为8⁴00 ng/ml,区间内线性系数为0.999;用建立的方法对同一份样品平行测定10次,变异系数小于10%;该方法的回收率为94.9%;联合疫苗中的其他主要成分,如丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)、黏附素(pertactin,PRN)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)、破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)对检测结果无明显干扰。结论建立了无细胞百日咳疫苗毒性体外检测方法,该方法有望替代现行的动物检查法,可加强我国百白破联合疫苗的质量控制,提高疫苗的质量。     

国产成人流感裂解疫苗的安全性观察

目的观察国产成人流感裂解疫苗的安全性。方法对2013年四川省内3岁及3岁以上人群接种长春生物制品研究所有限责任公司(简称长春公司)生产的成人流感裂解疫苗以及其余所有厂家的流感裂解疫苗(对照流感疫苗)后报告的疑似预防接种异常反应(adverse events following immunization,AEFI)情况进行回顾性调查。结果2013年四川省接种长春公司流感裂解疫苗后共报告AEFI 36例,报告发生率为11.78/10万,其中一般反应发生率为8.5/10万,异常反应发生率为2.62/10万。与对照流感疫苗相比,长春公司流感疫苗的大年龄组别不良反应构成比较高。接种长春公司流感疫苗后,一般反应(发热、硬结、红肿)的发生率低于对照流感疫苗;除荨麻疹外,其余异常反应的报告发生率均低于对照流感疫苗;疫苗的异常反应无批号聚集性。结论长春公司生产的成人流感裂解疫苗安全性较好。     

15价肺炎球菌结合疫苗动物急性、长期毒性及免疫原性

目的 评价15价肺炎球菌结合疫苗（15-valent pneumococcal conjugate vaccine,PCV15）的动物急性、长期毒性及免疫原性。方法 将60只ICR小鼠随机分为磷酸铝佐剂对照组、0.9%NaCl对照组和2人份剂量PCV15组,每组20只,雌雄各半,进行急性毒性试验;将90只SD大鼠随机分为磷酸铝佐剂对照组、0.9%NaCl对照组和1人份剂量PCV15组,每组30只,雌雄各半,共免疫5次,间隔28 d,进行长期毒性试验;将45只NIH小鼠随机分为0.9%NaCl组、1/4人用剂量的市售13价肺炎球菌结合疫苗（PCV13）组和1/4人用剂量的PCV15组,每组15只,雌性,共免疫3次,间隔2周,进行免疫原性试验及免疫过程中安全性观察,全程监测并记录小鼠的体质量、体征及行为变化,并在每次免疫2周后经眼眶采血,间接ELISA检测血清中抗各型肺炎链球菌荚膜多糖抗体水平。结果 急性毒性试验表明,注射2人份剂量PCV15后,小鼠均未出现明显异常反应或死亡。长期毒性试验显示,1人份剂量的PCV15对大鼠临床症状、血液学和血清生化指标无明显影响,各器官未见明显病理学异常。...     

疫苗免疫毒理学评价的研究进展

由于疫苗引起的不良反应多与免疫反应相关,因此免疫毒理学评价在疫苗的安全性评价中显得尤为重要。本文就疫苗免疫毒性包括超敏反应、免疫抑制和自身免疫反应的发生机理及其评价方法的研究进展作一综述。     

国产与进口DMEM培养基培养CHO-C28细胞效果比较

目的比较国产与进口DMEM培养基培养CHO-C28细胞的效果。方法采用国产DMEM培养基与进口DMEM培养基培养同批CHO-C28细胞,收集培养上清,检测HBsAg表达水平。采用相同条件纯化培养上清中的HBsAg,比较二者的层析图谱及纯化抗原的电泳图谱。并用其抗原制备疫苗,进行异常毒性和效力试验。结果培养上清中HBsAg表达水平,国产培养基略好于进口培养基,二者纯化图谱和抗原电泳图谱一致。两种培养基制备的疫苗异常毒性试验均合格,小鼠效力试验结果差异无显著意义。结论国产培养基在细胞培养中安全、有效,达到进口培养基水平,可用于规模化生产。     

不同裂解工艺制备的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的透射电子显微镜观察

目的透射电子显微镜观察不同工艺制备的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗形态,筛选最佳裂解工艺,为疫苗的大规模生产提供参考依据。方法应用透射电镜对4种不同裂解工艺制备的甲型H1N1流感病毒疫苗进行形态观察,采用中和试验分析其免疫原性,异常毒性试验分析其安全性。结果透射电镜观察显示4种样品均无完整病毒,样品1裂解程度最大,囊膜破裂,多数为病毒碎片;样品2大多数囊膜未破损,缺少纤突;样品3较完整的病毒颗粒略小(约30~40 nm),纤突清晰;样品4大多数病毒颗粒保留着纤突,但纤突已不整齐清晰。样品2组小鼠中和抗体滴度最低,而样品1、3、4组较高,与样品2组相比,差异明显,其中以样品3组最高;样品2组小鼠、豚鼠体重增加不明显,而样品1、3、4组小鼠、豚鼠体重增加明显,与样品2组相比差异显著,其中以样品3组最明显。结论电镜观察可直观反映疫苗裂解程度;3种裂解工艺均可用于疫苗生产,其中样品3具有较好的免疫原性和安全性,其工艺可作为最佳裂解工艺用于后续疫苗生产。     

冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性

目的观察冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在2~8℃条件下的稳定性。方法将冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗放置在2~8℃条件下,定期取样,检查其物理外观,检测多糖含量、水分含量和分子大小,并进行鉴别试验以及异常毒性和免疫原性试验,考察其稳定性。结果冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗于2~8℃保存30个月,各项质量控制指标仍符合该疫苗企业注册标准。结论冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在2~8℃条件下,其质量稳定。     

水痘减毒活疫苗(SV-1细胞)的大鼠长期毒性试验

目的观察SD大鼠注射水痘减毒活疫苗(SV-1细胞)后可能出现的毒性反应、毒性反应的恢复情况及可能出现的延迟性毒性反应。方法将SD大鼠随机分为8组,1~4组(主试验组)分为阴性对照组(生理盐水,2.5 ml/只)、细胞基质对照组(SV-1细胞基质,2.5 ml/只)、疫苗低剂量组(水痘减毒活疫苗1剂)和疫苗高剂量组(水痘减毒活疫苗5剂),每组30只;5~8组(卫星组)分组同1~4组,每组10只。均经大鼠颈背部皮下单点注射,每2周注射1次,连续注射3次,末次免疫后6周为恢复期。试验期间进行一般临床观察、体重、食量、体温、眼科、血细胞计数、凝血功能、血液生化、免疫指标、大体解剖观察、主要脏器称重、组织病理学等检查。结果试验期间,主试验组各组动物一般状况良好,各项指标检测均未见有毒理学意义的规律性改变,且动物脏器重量均未见与疫苗相关的明显改变,各组织脏器大体解剖观察均未见明显与给药相关的毒性病理学改变,注射局部组织未见明显与疫苗相关的刺激性反应;卫星组大鼠免疫前血清抗体均为阴性,末次免疫后2周,阴性对照组和细胞基质组抗体检测结果均为阴性,低剂量组和高剂量组抗体阳转率100%,抗体几何平均滴度(GMT)分别为1∶73.5和1∶111.4,仅有部分大鼠可检测到分泌IFNγ的T淋巴细胞。结论水痘减毒活疫苗(SV-1细胞)经大鼠长期毒性试验未见明显毒性反应,初步证实该疫苗具有良好的安全性及有效性。