抗rhTNFα杂交瘤细胞的体外培养及抗体分泌的研究

采用非CO2依赖培养基（CO2-IM）在无CO2、37℃条件下培养抗rhTNFα杂交瘤细胞，培养1周PH无显著变化，细胞生长趋势和抗体分泌显著超过DMEM。将CO2－IM与SFPF－HM混合后添加ITSE可以培养抗rhTNF杂交瘤细胞，其细胞生长速率、密度、活力和抗体产量均达到或超过含血清培养。     

抗人A血型杂交瘤细胞高密度培养条件的研究

抗人 A 血型杂交瘤15B_4细胞在 CelliGen 细胞培养罐中进行连续灌注培养,细胞密度达1.6×10~7/ml。每天灌注新培养液量由1000ml 增到2300ml,第14天后又逐日减少至1000ml,死细胞数随着转速的增加和灌注量的减少而增多。血凝效价呈梯度上升,滴度达到2~(14),相当于腹水效价。培养6天 IgM 产量为0.2克/升/天,10～18天波动在1.45～1.8克/升/天。15B_4细胞代谢与葡萄糖、乳酸有关,与氨无关。CelliGen 自控效果较好,适用于杂交瘤细胞的高密度培养。搅拌速度在120～150r/min 对细胞产生的剪切力有明显地破坏作用。溶氧控制系统有待改进。     

生物反应器无血清悬浮培养MDCK-siat7e细胞工艺的建立

目的建立无血清无蛋白无动物源性培养基BD001悬浮培养MDCK-siat7e细胞的工艺,为MDCK-siat7e细胞的生物反应器规模化培养及病毒性疫苗的研制提供依据。方法采用BD001驯化MDCK-siat7e细胞,建立无血清无蛋白无动物源性MDCK-siat7e细胞库,对细胞库进行常规检定,观察MDCK-siat7e细胞的生长形态;比较不同起始接种密度(4.0×10~5、8.0×10~5、1.6×10~6 cells/ml)悬浮培养,MDCK-siat7e细胞达到平台期的时间、平台期细胞密度及活率;比较不同规模生物反应器(3、15、60 L)无血清无蛋白无动物源性培养MDCK-siat7e细胞对数生长期的比生长速率(μ)、分裂次数(Cd)、葡萄糖比消耗速率(q_(gluc))、乳酸对葡萄糖的转化率(Y_(lac)/g_(luc)),观察细胞的生长和代谢情况。结果建立的无血清无蛋白无动物源性MDCK-siat7e细胞库复苏后细胞平均活率为(96.20±2.95)%。MDCK-siat7e细胞在BD001培养基中复苏传代后生长状态良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第6天进入平台期,第8天达最大细胞密度(6.2×10~6 cells/ml),维持至第12天细胞密度和活率开始下降,进入衰亡期。MDCK-siat7e细胞在无血清培养基中生长良好;不同起始接种密度MDCK-siat7e细胞达到平台期的时间差异有统计学意义(P0.05),平台期细胞密度及活率差异无统计学意义(P0.05);不同规模生物反应器培养的MDCK-siat7e细胞的μ、Cd、q_(gluc)、Y_(lac/gluc)差异均无统计学意义(P0.05),细胞生长代谢良好。结论建立了生物反应器无血清悬浮培养MDCK-siat7e细胞的工艺,为病毒性疫苗生产中采用无血清无蛋白、无动物源性培养基,生物反应器规模化培养MDCK-siat7e细胞提供了一定的实验依据。     

~(60)Co γ-射线辐照新生牛血清对细胞培养的影响

目的研究新生牛血清(newborn calf serum,NBCS)经~(60)Coγ-射线辐照后对细胞培养的影响。方法用20 k Gy~(60)Coγ-射线辐照NBCS后,培养Vero和CHO-K1细胞,通过连续传代培养及绘制低密度生长曲线,比较辐照前后的促细胞生长效果。结果 Vero细胞的传代培养结果与未辐照前接近,生长曲线峰值略低于未辐照组,辐照前后细胞的最大增殖密度为73.38×10~4和65.33×10~4个/ml(P0.05),倍增时间为24.38和25.33 h(P0.05);CHOK1细胞传代培养无未辐照组致密,生长曲线较未辐照组平缓,辐照前后细胞的最大增殖密度为80.03×10~4和79.3×10~4个/ml(P0.05),倍增时间为19.73和23.62 h(P0.05)。结论 NBCS经20 k Gy ~(60)Coγ-射线辐照后,对Vero细胞影响不明显,使CHO-K1细胞生长速度变慢。     

乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖条件的优化

目的优化乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件。方法以乙型流感病毒感染无血清悬浮培养的MDCK细胞,对培养条件中的MOI(10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)、10~(-7))、胰酶终浓度(2. 5、5、7. 5、10、15、20μg/mL)、细胞接毒密度(50×10~4、100×10~4、300×10~4、500×10~4、700×10~4个/mL)及病毒收获时间(24、48、72、96、120 h)进行优化。同时对流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖情况进行比较。结果乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上最适增殖条件为:MOI为10~(-2)、胰酶终浓度为10μg/m L、细胞接毒密度为300×10~4个/mL、病毒收获时间为72 h。流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖的HA血凝滴度及病毒滴度(CCID_(50))均明显高于贴壁培养的MDCK细胞(P 0. 05)。结论优化了乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件,为后续采用生物反应器大规模生产流感疫苗奠定了基础。     

C50株抗CEA杂交瘤细胞抗体生成动力学及体外培养条件的优化

目的　研究C5 0株抗CEA杂交瘤细胞的抗体生成动力学 ,确定优化体外培养条件。方法　体外静态培养C5 0细胞 ,采用ELISA和细胞计数的方法检测培养上清抗体浓度和细胞数量 ,分析细胞生长与抗体分泌的关联性。采用体内复壮和添加新型免疫增强剂CpGODN的方法 ,尝试恢复长期体外培养的C5 0细胞的抗体生成能力。结果　C5 0细胞的抗体生成动力学为非生长关联型 ,经过体内复壮 ,C5 0细胞体外培养上清中抗体浓度显著提高 ,但活细胞密度或细胞活力均未发生明显变化。在培养基中添加一定浓度的CpGODN ,可以恢复长期体外培养的C5 0细胞的抗体生成能力。结论　根据细胞的抗体生成动力学特征 ,通过调节细胞的生长状态 ,可提高上清抗体浓度。根据抗体基因的组织特异性表达的机制 ,通过优化杂交瘤细胞的体外培养条件 ,能保持细胞正常的抗体生成能力 ,维持细胞高且稳定的上清抗体浓度     

重组大肠杆菌HT02高密度高表达HT-1融合蛋白发酵过程优化

发酵工艺放大是将实验室成果产业化的必要一环,随着发酵规模的扩大,工艺流程也会有相应的调整,导致微生物所处的生长环境以及生长代谢状态的改变,从而影响大体积发酵罐的发酵水平。本文以一株产HT-1融合蛋白的重组大肠杆菌HT02为研究对象,在200 L发酵罐中研究了分批补料培养时菌体生长与HT-1融合蛋白表达的特性,通过采用提前诱导、增加接种量的手段,解决了因增加二级种子培养工艺而导致的200 L发酵罐中HT-1融合蛋白表达水平下降的问题,最终使菌体密度、HT-1融合蛋白表达水平、融合蛋白细胞得率以及融合蛋白体积得率分别达到55.1 g·L^-1、27.4%、0.056 g·(g cell)^-1和3.103 g·L^-1,较工艺改进前发酵水平分别提高了9.8%、23.4%、14.3%和25.2%,实现了在200 L发酵罐中高密度高表达发酵,为HT-1工业化生产提供了指导。     

在无血清培养基中代谢副产物对杂交瘤细胞生长代谢的影响:Ⅱ.氨的作用

目的 在无血清培养基中，研究氨对杂交瘤细胞生长代谢的影响。方法 在培养基中添加不同浓度的氨，考察细胞生长和代谢及单抗生成的变化。结果 添加0．8mmol/L）的氨时就对细胞生长和代谢有影响，当氨浓度达4mmol/L时，对细胞的生长代谢有明显的抑制，当培养基中氨浓度高于6mmol/L时，细胞生长停止，代谢受到严重影响。氨的添加降低了培养上清中的单抗浓度，但提高了单抗的比生产速率。结论 氨对细胞生长和代谢有较大的影响，对单抗浓度的影响主要由细胞密度降低造成，单抗的比生产速率增加。     

肺炎链球菌免疫小鼠程序的优化及杂交瘤细胞株的建立

目的优化肺炎链球菌CSR SCS2 clone1小鼠的免疫程序,同时建立肺炎链球菌C多糖(C polysaccharides,CPs)杂交瘤细胞株。方法制备免疫抗原CSR SCS2 clonel,进行小鼠免疫程序优化:抗原量[(0. 5～2)×10~8个、(1～4)×108个、(2. 4～10)×10~8个)]、免疫间隔时间(3 d、1周、2周)、免疫途径(腹腔、腹股沟及尾静脉),同时确定抗原是否添加佐剂,间接ELISA法检测小鼠血清抗体水平。采用优化程序免疫小鼠,取血清效价最高的小鼠脾细胞,经传统单克隆抗体制备技术建立肺炎链球菌C-Ps杂交瘤细胞株,并检测细胞株的染色体数目及其分泌抗体的稳定性及特异性。结果确定小鼠最适免疫程序为:抗原量为(1～4)×108个,且需添加弗氏佐剂,免疫间隔时间为1周,免疫途径为腹股沟注射。最适程序免疫小鼠血清抗体效价达1∶12 000以上。建立了3株肺炎链球菌C-Ps杂交瘤细胞,命名为A4、G8、H10株,染色体数目分别为98、102和102,分泌的抗体具有良好的稳定性和特异性。结论成功优化了肺炎链球菌小鼠的免疫程序,并建立了肺炎链球菌C-Ps杂交瘤细胞株,为肺炎链球菌荚膜多糖中C-Ps含量检测方法的建立奠定了基础。     

无血清培养Vero细胞及其传代稳定性分析

目的建立无血清无动物源性培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞的工艺,并分析其传代稳定性。方法采用VP-SFM适应培养Vero细胞,建立无血清无动物源性Vero细胞库,对细胞库进行常规检定;绘制VP-SFM培养Vero细胞的生长曲线;比较140、150、160代Vero细胞在VP-SFM中培养的比生长速率(μ)和分裂次数(Cd);比较142、147、153代Vero细胞在VP-SFM中培养的狂犬病病毒滴度;比较无血清与含血清培养140、150、160代Vero细胞的μ和Cd值;分别在250 ml spinner flask中加入2 g/L cytodexⅠ、在3 L生物反应器中加入3 g/L cytodexⅠ培养Vero细胞,观察细胞贴壁和生长情况。结果建立的无血清无动物源性Vero细胞库,细胞密度为4×10~6个/ml,冻存前细胞活率为100%,复苏后细胞平均活率为(94.20±3.95)%,无菌检查和支原体检查合格;细胞在VP-SFM中复苏传代后生长良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第8天进入平台期,第12天达最大细胞密度20.5×10~5个/ml,并维持至第14天,活细胞数开始下降,最大μ值为0.025 4 h~(-1)。Vero细胞在无血清培养基中传代稳定性较好,140、150、160代Vero细胞在VP-SFM培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P0.05);142、147、153代Vero细胞在VP-SFM培养的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义(P0.05);140、150、160代Vero细胞在无血清和含血清培养基培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P0.05)。在生物反应器微载体系统中,采用无血清培养基培养Vero细胞,细胞贴壁及生长状态良好。结论初步建立无血清、无动物源性物质的Vero细胞库,采用方瓶静置培养或微载体搅拌培养,细胞生长状态均良好,传代稳定性也较好。     

Production of bacterial cellulose by Gluconacetobacter hansenii using a novel bioreactor equipped with a spin filter

In order to improve bacterial cellulose (BC) production yield by increasing the cell density, a new fermentation system using a spin filter was developed and its performance characteristics were tested. Fermentations were carried out in a fermenter equipped with a 6 flat-blade turbine impeller and a spin filter consisting of a cylinder surrounded by stainless steel mesh and whose stainless steel bottom was attached to the agitator shaft. This new fermentation assembly was tested under different experimental conditions for BC production by Gluconacetobacter hansenii PJK. In periodical perfusion culture without pH control, the BC production and the total cell mass increased with the culture time to 3.07 and 5.65 g/L, respectively, at 140 h of cultivation. The BC production was also tested at adjusted pH and pH 5 was found optimum for maximum BC production. At pH 5, in periodical perfusion culture, the BC production and the total cell mass reached to 4.57 and 11.52 g/L, respectively, after 140 h of cultivation. This amount of BC production was 2.9 times higher than that obtained in a conventional jar fermenter. The productivity improved and was 0.044 g/L·h at 68 h of cultivation.     

表达重组人可溶性TRAIL的毕氏酵母发酵工艺

目的优化rhsTRAIL毕氏酵母工程菌在5L发酵罐中的发酵表达工艺参数。方法研究培养基种类、细胞密度、甘油含量、pH值、甲醇浓度、甲醇流加速率及诱导时间等参数对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并用电镜观察其诱导肿瘤细胞凋亡特征。结果在无机盐培养基中,按10%接种A600=8～12的种菌后,24h酵母菌增殖至A600=76;甘油含量为1%时,菌体生长速度快(A600=160);培养基pH值5.0,甲醇终浓度为1%时,诱导96h表达量最高达到120mg/L,并具有诱导肿瘤细胞凋亡特征。结论rhsTRAIL毕氏酵母的发酵工艺参数为无机盐培养基,pH值5.0,接种10%A600=8～12的种菌,甘油含量1%,甲醇终浓度1%,诱导96h。     

Microcarrier cell culture and its application to the large-scale production of human fibroblast interferon

Animal cells are important in producing several products, but anchorage-dependency of most cell strains is one of the difficulties to get over. Microcarrier was utilized in this study in order to increase the surface area for cell-anchorage and also to improve other characteristics of the cell culture system. First the critical parameters affecting the initial attachment were determined. The best plating efficiency was found at pH = 7.4 and 5% FCS concentration. Use of the intermittent stirring during the initial phase of cell culture gave better cell plating than the continuous stirring. Next the human fibroblast interferon was successfully produced from cells cultured on microcarrier and several advantages of using microcarrier were identified. Usually 10,000 units/ml of interferon was produced from microcarrier culture as compared to 6,000 units/ml in monolayer culture. FCS concentration in cell growth stage affected the yield of interferon and gave optimum results at 5%. Antibiotics did not influence the production of interferon significantly. The highest sensitivity in interferon assay was obtained with Hep 2 cells as the target cells and more than 3 x 10⁵ cells/ml were needed for good result. Microcarrier culture fixed onto confluent monolayer showed results as good as suspension microcarrier culture.     

单克隆抗体免疫结合物~(125)Ⅰ—3A_1在裸鼠淋巴瘤模型体内示踪研究

本文报道利用~(125)I 标记的抗 CD_7抗原决定簇的单抗 3A_1,在人 T 淋巴瘤裸鼠模型及人鼻咽癌裸鼠模型体内进行生物学分布和显像研究。注射标记抗体26小时后,淋巴瘤裸鼠模型中出现肿瘤显像。96小时后处死裸鼠,测定肿瘤及各器官中的放射性分布,结果表明 McAb 3A_1在 CEM 荷瘤裸鼠的肿瘤组织中有特异性的浓集。~(125)I 标记的对照抗体,鼠抗乙型肝炎病毒核心抗原抗体,在 T 淋巴瘤裸鼠模型的肿瘤部位无明显浓集。     

天然N-末端人白细胞介素-29成熟肽在毕赤酵母中表达条件的优化

目的优化天然N-末端人白细胞介素-29(Human interleukin-29,hIL-29)成熟肽在毕赤酵母中的表达条件,高效表达天然N-末端hIL-29成熟肽。方法采用单因素试验和L(934)正交试验,分析摇瓶发酵条件下甲醇添加量、起始pH值、诱导时间及诱导温度对毕赤酵母工程菌GS115/hIL-29发酵液A450值的影响;用5 L发酵罐初步探索工程菌株的高密度发酵策略。结果影响重组毕赤酵母摇瓶发酵液A450值的因素重要性依次为:诱导温度>起始pH值>甲醇添加量>诱导时间,最佳发酵条件为:起始pH值7.5、甲醇添加量1.5%、26℃诱导60 h,在此条件下,发酵液的A450值达1.72;高密度发酵策略为:pH 7.5,甲醇与溶氧反相偶联,26℃诱导12 h,在此条件下,目的蛋白的表达量明显高于摇瓶水平;高密度发酵12、24 h表达的蛋白与羊抗人IL-29多抗的反应强度明显高于摇瓶发酵表达的蛋白。结论优化了工程菌株GS115/hIL-29摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵条件,实现了重组天然N-末端hIL-29成熟肽在毕赤酵母GS115中的高效表达,为其进一步的中试放大工艺奠定了基础。     

锂二次电池正极材料用四氧化三锰的制备研究

在75℃,pH值为6.5下,以一水硫酸锰为原料,采用空气直接氧化法,当控制Mn2+浓度为60～70 g/L,调节适当的空气流量和搅拌速度,反应12 h,即可制备得到符合锂二次电池正极材料用的四氧化三锰,产物为类球形貌,晶形完整,该Mn3O4振实密度大于1.85 g/m3,Mn含量高于70.5%,S含量低于0.15%,主要金属杂质含量均在30×10-6以下,中位粒径在6～14μm范围内。     

混合溶剂中硫酸镁离子对缔合常数的测定及其影响因素

应用电动势法在278.15～318.15K温度范围内测定了无液接电池(A)的电动势:　Pt,H2(101.325kPa)|HCl(m1),MgSO4(m2),尿素(10%)-H2O|AgCl-Ag(A)根据测得的电池(A)的电动势,确定了混合溶剂中硫酸镁离子对的缔合常数K。通过K值首先讨论了温度对硫酸镁缔合常数的影响,结果表明符合Hamed-Robinson经验方程:pK=A1/T+A2+A3T。其次,讨论了溶剂介电常数D对K的影响,得出经验方程:pK=g+h/D。     

Enhanced immunomodulatory activity of gelatin-encapsulated Rubus coreanus Miquel nanoparticles

The aim of this work was to investigate the immunomodulatory activities of Rubus coreanus Miquel extract-loaded gelatin nanoparticles. The mean size of the produced nanoparticles was 143 ± 18 nm with a bandwidth of 76 nm in the size distribution and a maximum size of ~200 nm, which allows effective nanoparticle uptake by cells. Confocal imaging confirmed this, since the nanoparticles were internalized within 30 min and heterogeneously distributed throughout the cell. Zeta-potential measurements showed that from pH = 5 onwards, the nanoparticles were highly negatively charged, which prevents agglomeration to clusters by electrostatic repulsion. This was confirmed by TEM imaging, which showed a well dispersed colloidal solution. The encapsulation efficiency was nearly 60%, which is higher than for other components encapsulated in gelatin nanoparticles. Measurements of immune modulation in immune cells showed a significant effect by the crude extract, which was only topped by the nanoparticles containing the extract. Proliferation of B-, T- and NK cells was notably enhanced by Rubus coreanus-gelatin nanoparticles and in general ~2-3 times higher than control and on average ~2 times higher than ferulic acid. R. coreanus-gelatin nanoparticles induced cytokine secretion (IL-6 and TNF-α) from B- and T-cells on average at a ~2-3 times higher rate compared with the extract and ferulic acid. In vivo immunomodulatory activity in mice fed with R. coreanus-gelatin nanoparticles at 1 mL/g body weight showed a ~5 times higher antibody production compared to control, a ~1.3 times higher production compared to the extract only, and a ~1.6 times higher production compared to ferulic acid. Overall, our results suggest that gelatin nanoparticles represent an excellent transport vehicle for Rubus coreanus extract and extracts from other plants generally used in traditional Asian medicine. Such nanoparticles ensure a high local concentration that results in enhancement of immune cell activities, including proliferation, cytokine secretion, and antibody production.     

高铁离子浓度下氧化亚铁硫杆菌的生长行为

测定了氧化亚铁硫杆菌在高铁离子浓度下的生长曲线、溶液pH的变化、T.f.菌对亚铁氧化情况及溶液氧化还原电位(Eh)的变化规律. 实验发现T.f.菌在[Fe2+]<70 g/L及pH=1.6~2.0、接种量10%的条件下生长良好,培养时间为10 d后细菌浓度可以达到(0.8~31.6)′107个/ml.