重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质及其偶联辅酶再生

为解决生物催化氧化还原反应中辅酶循环问题,人工合成密码子优化后的嗜酸热源体Thermoplasma acidophilum葡萄糖脱氢酶基因Sygdh,于E.coli BL21(DE3)中表达,粗酶液经镍柱亲和层析获得纯化的重组葡萄糖脱氢酶SyGDH。SDS-PAGE显示相对分子质量为41.0 kDa。酶学性质分析表明:该酶的最适pH值为7.5,在pH 6.0~8.0稳定;最适反应温度为40℃,在55℃以下稳定;最适条件下其比活性达4.5 U/mg;Zn2+对其有明显激活作用;该酶对NADP+的亲和力大于NAD+且对大多数有机溶剂有良好的耐受性;对D-葡萄糖的Km和Vmax值分别为28.2 mmol/L和6.5 U/mg。在葡萄糖脱氢酶与羰基还原酶偶联构建的NADPH辅酶循环体系中,以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,羰基还原酶催化产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的产率为99.0%,是未添加葡萄糖脱氢酶时产物产率的3.11倍,表明重组SyGDH具有为生物催化氧化还原反应提供辅酶NADPH再生的能力。     

木糖还原酶基因整合表达载体构建

木糖还原酶是酵母代谢木糖发酵的关键酶之一。根据已报道的木糖还原酶基因的全序列设计引物,从休哈塔假丝酵母中克隆得到1 110 bp大小的片段。将木糖还原酶基因亚克隆到酿酒酵母的整合表达载体p406ADH1中,醋酸锂转化法将线性化重组质粒p YX-AK-xyl1转化到酿酒酵母W5,对阳性转化子进行酶活测定,结果表明,以辅酶DANH和NADPH为底物诱导,转化子均表现出活性,酶活分别为6.513 U/mg和7.080 U/mg,是受体菌W5酶活的1.4倍(NADH)和1.3倍(NADPH),其酶活比为0.919。     

谷氨酸生产菌S_(9114)中依赖于NADPH谷氨酸脱氢酶的纯化及性质

利用DEAE 纤维素离交柱层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析等从谷氨酸棒杆菌S9114 中分离纯化出依赖于NADPH的谷氨酸脱氢酶 (GOH NADPH )。经HPLC测定 ,该酶的分子量为 188ku ;经SDS -PAGE电泳测得该酶的亚基分子量为 3 2ku。提示该谷氨酸脱氢酶由 6个亚基组成。该酶对NADPH具有高度专一性 ,在pH 7 5、3 7℃下 ,以α 酮戊二酸、NH4Cl和NADPH为底物时的米氏常数Km 分别为 9 2 2mmol/L、5 2 7mmol/L和 2 3 1× 10 -3mmol/L。最适反应pH为 7 5 ,最适反应温度为 42℃ ,并对热比较稳定。此外 ,KCl对GDH NADPH的活性具有激活作用。     

发酵液中酮基还原酶活性测定方法的构建

本研究以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）为底物,还原型辅酶Ⅱ （NADPH）为辅酶,应用紫外-可见光分光光度计法测定发酵液中酮基还原酶活性,通过连续测定NADPH消耗量来计算酶活力,得到了最佳反应体系：NADPH浓度为0.2 mmol/L,COBE浓度为1.0 mmol/L,磷酸缓冲溶液浓度为100 mmol/L、pH值为6,反应温度为40℃.在此条件下平行检测5次酶活,相对标准偏差（RSD）为0.48％.此方法操作简便,耗时短,精确度高,重复性好,可作为发酵液中酮基还原酶活性测定方法加以推广.     

南美白对虾血淋巴脂肪氧合酶的分离纯化及其生化特性研究

用羟基磷灰石柱层析法分离纯化南美白对虾血淋巴脂肪氧合酶,同时进行酶学性质及其反应产物研究,为南美白对虾资源的综合利用、虾风味形成机制的研究提供依据。结果显示:以亚油酸为底物,南美白对虾血淋巴脂肪氧合酶最适温度为25℃,最适pH9.6,最适底物浓度0.25mmol/L,Vmax值为1.67×103U/mg蛋白·min,Km值为0.5mmol/L,1mmol/L的谷胱苷肽能有效提高酶液稳定性;该酶对3种不饱和脂肪酸的亲和力依次为C20∶4>C18∶2>C18∶3;利用正相高效液相色谱分析,南美白对虾血淋巴脂肪氧合酶催化亚油酸甲酯只形成13-氢过氧化物。     

酶法水解大豆异黄酮

利用Absidiasp R菌株 ,通过液体发酵 ,得到了一种高活性的大豆异黄酮糖苷水解酶 ,该酶水解糖苷型大豆异黄酮的最适底物浓度为 7 5mg/mL ;最适反应时间为 1 5h ;该酶在温度为 2 0～5 0℃、pH为 4 0～ 7 0范围内相对稳定 ,最适酶解反应温度为 40℃ ,最适pH值为 5 0 ;金属离子对该酶活力的影响不显著 ,其中Co2 +、Zn2 +对该酶有激活作用 ,Ag+、Cu2 +对该酶有抑制作用 ,Fe3+浓度<5 0mmol/L时 ,对该酶有促进作用 ,当离子浓度 >5 0mmol/L时 ,则有抑制作用。利用实验获得的最适酶解条件反应 ,可使染料木苷生成染料木素的转化率达到 1 0 0 %。     

乙醛脱氢酶的克隆表达及其酶学性质

将Gene Bank中人源乙醛脱氢酶2的基因序列根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的密码子偏好性进行密码子优化后合成目的基因ALDH2,采用融合PCR技术,构建人源ALDH2基因的表达组件TRP1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-TRP1R。通过电转化的方法将基因表达组件通过同源重组整合到酿酒酵母W303-1A的基因组上,获得基因工程菌W303-ALDH2。工程菌发酵后的粗酶液经His TrapTMexcel亲和层析柱纯化获得重组ALDH2,其活性为20.70 U/mg;重组酶的相对分子质量是56 k Da;最适反应pH和温度分别为5.0和35℃;除Na+外,K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+均能不同程度地提高ALDH2的酶活。以乙醛为底物测得酶的Km值为0.908 mmol/L,最大反应速度Vmax为114.94 U/mg;以辅酶NAD+为底物测得酶的Km值为0.282 mmol/L,最大反应速度Vmax为58.82 U/mg。     

猪脑乙酰胆碱酯酶的分离纯化和性质研究

通过离心、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose和Superdex-200层析等步骤,从猪脑中获得电泳纯乙酰胆碱酯酶,该酶比活力和纯化倍数分别为2.05 U/mg和26.97,酶活回收率为11.95%;该酶分子质量为257.30 kD,亚基为66.94 kD;以碘化硫代乙酰胆碱为底物时,酶的最适反应温度为37 ℃,最适pH值为7.4,且在40 ℃以下,pH 6.0～8.0有较好的稳定性;最适底物浓度为4.0 mmol/L,Km为0.94 mmol/L。Ba2+和Zn2+对该酶有强烈的抑制作用,而低浓度Mg2+对该酶有激活作用。     

山楂多酚氧化酶的酶学特性研究

研究山楂多酚氧化酶(PPO)的酶学特性。采用分光光度法测定PPO的酶活性,考察底物特异性、p H值、温度、热稳定性、底物浓度、金属离子以及抑制剂对PPO酶活性的影响。实验结果表明,山楂PPO的最适底物为邻苯二酚;最适p H值为6.5;最适温度为40℃;90℃热处理1.0 min或85℃处理1.5 min PPO酶活基本完全丧失;山楂PPO最适底物浓度为0.10 mol/L,PPO酶促褐变反应动力学符合米氏方程,相应的动力学参数Km=55.83 mmol/L,Vmax=98.04 U/min;Al3+对PPO酶活的抑制作用较强,Mn2+、Ca2+和Zn2+次之,Cu2+和Mg2+对PPO酶活抑制作用不明显,Fe3+对PPO酶活有一定的促进作用;四种抑制剂对山楂PPO酶活均有一定的抑制作用,且抑制效果与抑制剂浓度呈量效关系,相同浓度下抑制效果由强到弱顺序为:抗坏血酸L-半胱氨酸亚硫酸氢钠柠檬酸,抗坏血酸的抑制效果最为显著。     

重组枯草芽孢杆菌表达4-木糖醇脱氢酶的发酵和反应条件优化

L-木酮糖(L-苏式-戊酮糖)是一种昂贵的稀有戊糖,而4-木糖醇脱氢酶(xylitol-4-dehydrogenase,XDH)是生物合成L-木酮糖(L-xylulose)的关键酶。为了促进L-木酮糖的生产,对枯草芽孢杆菌外源表达4-木糖醇脱氢酶的发酵条件进行优化,并对以木糖醇为底物静息细胞催化反应合成L-木酮糖的反应条件进行研究。通过单因素实验确定了最佳培养基的成分(g/L)为:蔗糖25,尿素6,MgSO_40. 05,MnSO_40. 01,FeSO_40. 01,初始pH值8. 0。最佳发酵条件为:装液量40 mL(250 mL锥形瓶),接种量1. 67%,发酵培养温度28℃。在优化条件下4-木糖醇脱氢酶酶活为5. 183 U/L,与初始酶活相比提高了231. 2%。最优反应条件:底物质量浓度20 g/L,50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 10. 0),反应温度45℃,优化反应条件下转化率达到17. 74%。通过对菌株发酵和反应工艺条件的优化,为后续L-木酮糖工业化生产奠定了基础。     

Expression of xyrA gene encoding for D-Xylose reductase of Candida tropicalis and production of xylitol in Escherichia coli

The D-Xylose reductase (XR) gene (xyrA) of Candida tropicalis IFO 0618 was expressed in Escherichia coli JM109. The enzymatic properties of each recombinant XR such as the Km value for D-xylose and NADPH, the substrate specificity for other sugars and the optimal pH were essentially the same as those of the corresponding enzyme of C. tropicalis. The recombinant XR was more heat-stable than C. tropicalis XR at 60 degrees C. E. coli, expressing the xyrA gene, successfully converted D-xylose to xylitol. When D-xylose (50 g/l) and D-glucose (5 g/l) were added to IPTG-induced cells, 13.3 g/l of xylitol was produced during 20 h of cultivation.     

猪背最长肌焦磷酸酶的分离纯化与酶学特性

通过离心、50%～70%饱和硫酸铵沉淀、DEAE-52离子交换柱层析,从猪背最长肌中分离纯化出焦磷酸酶(PPase)。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示,PPase分子质量约72kD。焦磷酸酶酶学特性研究表明,最适反应温度和pH值分别为50℃和7.5。Mg2+是PPase的激活剂,在浓度4.75mmol/L时,酶活力最强。但Na+和K+都能抑制酶的活力,且Na+的抑制效果强于K+。PPase水解焦磷酸钠(TSPP)的动力学参数Vmax为0.086μmol/(L.min)),Km为0.36mmol/L。     

前体氨基酸对热带假丝酵母产谷胱甘肽的影响

以能利用木糖发酵产谷胱甘肽(GSH)的热带假丝酵母突变株CV26为实验菌株,分别研究了添加L-半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸3种前体氨基酸对CV26产GSH的影响。在单因素实验基础上,对3种前体氨基酸的添加进行了正交实验,结果表明:在GSH发酵的12h添加6mmol/L的甘氨酸和2mmol/L的谷氨酸,24h添加3mmol/L的L-半胱氨酸,GSH的产量和胞内含量都有较大的提高,分别达到149.28mg/L和20.43mg/g,比对照组分别提高了51.5%和57.8%。     

拟青霉FLH30 β-葡萄糖苷酶动力学、激活抑制及其转糖苷

研究了拟青霉FLH30胞内β-葡萄糖苷酶动力学性质及葡萄糖、木糖和葡萄糖醛酸内酯对该酶的激活及抑制作用。结果表明:该酶对p NP-β-D-葡萄糖苷、p NP-β-D-半乳糖苷、纤维二糖、乳糖、龙胆二糖和水扬苷的水解动力学常数Km分别为0.54、5.28、0.98、26.34、6.92和1.72 mmol/L;在以对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p NPG）为底物时,5¹50 mmol/L葡萄糖和20⁶00 mmol/L木糖对酶有激活作用,高于此范围,则表现出抑制作用,葡萄糖醛酸内酯具有很强的抑制作用,葡萄糖、木糖和葡萄糖醛酸内酯抑制常数Ki值分别为63.4、170.3和0.038 mmol/L。木糖能促进该酶对纤维二糖和乳糖的水解作用,木糖浓度为200 mmol/L时,酶活分别增加189.6%和166.3%。该酶还具有转糖苷活性,能够将纤维二糖部分转化为纤维三糖和龙胆二糖。      

热带假丝酵母木糖还原酶在酿酒酵母细胞表面展示

利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表面展示系统,将来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖还原酶基因xyl1嵌入带有His-Tag的酿酒酵母α-凝集素展示载体pICAS-His,构建重组质粒pICAS- His-Ctxyl1,并转化到酿酒酵母宿主菌酿酒酵母MT8—1,通过流式细胞仪快速检测和筛选,得到重组菌株MT8- 1/pICAS-His—Ctxyl1。将重组酵母用于葡萄糖(15g/L)和木糖(5g/L)的混合糖发酵研究,结果表明,重组酿酒酵母MT8/1/pICAS-His—Ctxyl1细胞具有良好的生长和产酶特性,同时能转化木糖生产木糖醇,在培养基中2.5g/ L木糖转化生成2.5g/L木糖醇,转化率达98.7%。     

热稳定酸性β - 葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

耐酸性黑曲霉菌株Aspergillus niger L.的菌丝体破碎液依次经过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤等步骤处理,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶,SDS-PAGE显示其分子质量为125.7kD。β-葡萄糖苷酶水解对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷的最适pH值为3.0～4.0,最适温度为70℃,表观米氏常数(Km)值为2.35mmol/L,表观kcat/Km值为2.99×104L/(mol ·s);水解京尼平苷、水杨苷的表观kcat/Km值分别是1.26×104、1.37×104L/(mol ·s);水解活性受Mn2+的显著激活和Fe2+、Zn2+、Cu2+等离子的微弱抑制。该酶活性在pH2.0～8.3保持稳定;酶在65℃时保温60min,残余酶活达到了85%,是一种热稳定酸性β-葡萄糖苷酶。     

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶的分离纯化及其酶学特性

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶经强阴离子柱、高效制备液相色谱和多肽分子筛纯化得到液相级纯酶(95.6%)。该酶比活力为125 U/g,纯化倍数为446,回收率为2.39%。纯化后的类胡萝卜素裂解酶经液相色谱-质谱联用测定,得其分子质量为655.093 D。关于酶学特性,研究发现该酶对C_(40)类胡萝卜素底物的最适温度为60℃,而作用于β-阿朴-8’-胡萝卜醛的最适温度是50℃,该酶的稳定温度为50℃以下;该酶对所测定底物的最适p H值为3.0;该酶与5种底物亲和力排列为:玉米黄质虾青素β-胡萝卜素角黄质β-阿朴-8’-胡萝卜醛;Al~(3+)和Fe~(3+)是该酶的强效催化剂,Fe~(2+)是该酶的强效抑制剂;H_2O_2在低浓度范围内(0~16 mmol/L)可促进酶活性;低体积分数乙醇(4%~16%)的添加对酶活性无明显抑制作用。结果表明该酶具有很好的耐酸性和热稳定性,能够适应果酒环境,为其工业化应用提供依据。     

Saccharomyces cerevisiae engineered for xylose metabolism requires gluconeogenesis and the oxidative branch of the pentose phosphate pathway for aerobic xylose assimilation

Saccharomyces strains engineered to ferment xylose using Scheffersomyces stipitis xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH) genes appear to be limited by metabolic imbalances, due to differing cofactor specificities of XR and XDH. The S. stipitis XR, which uses both NADH and NADPH, is hypothesized to reduce the cofactor imbalance, allowing xylose fermentation in this yeast. However, unadapted S. cerevisiae strains expressing this XR grow poorly on xylose, suggesting that metabolism is still imbalanced, even under aerobic conditions. In this study, we investigated the possible reasons for this imbalance by deleting genes required for NADPH production and gluconeogenesis in S. cerevisiae. S. cerevisiae cells expressing the XR-XDH, but not a xylose isomerase, pathway required the oxidative branch of the pentose phosphate pathway (PPP) and gluconeogenic production of glucose-6-P for xylose assimilation. The requirement for generating glucose-6-P from xylose was also shown for Kluyveromyces lactis. When grown in xylose medium, both K. lactis and S. stipitis showed increases in enzyme activity required for producing glucose-6-P. Thus, natural xylose-assimilating yeast respond to xylose, in part, by upregulating enzymes required for recycling xylose back to glucose-6-P for the production of NADPH via the oxidative branch of the PPP. Finally, we show that induction of these enzymes correlated with increased tolerance to the NADPH-depleting compound diamide and the fermentation inhibitors furfural and hydroxymethyl furfural; S. cerevisiae was not able to increase enzyme activity for glucose-6-P production when grown in xylose medium and was more sensitive to these inhibitors in xylose medium compared to glucose.     

白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶的纯化及酶学特性

通过粗分离、50%～80%饱和度硫酸铵分级沉降、DE-52阴离子交换柱层析等步骤,从白鲢鱼背侧肌中分离纯化出焦磷酸酶。通过变性凝胶电泳分析,该酶在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中仅有一个分子质量为40 kD的条带。酶学特性研究表明,白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶可专一性地水解焦磷酸盐,反应初速率时间范围为0～15 min,最适反应温度为45 ℃,最适反应pH值为7.5。Mg2＋对该酶有明显的激活作用,在Mg2＋浓度为5 mmol/L时酶活力最高。5 mmol/L的Ca2＋、Zn2＋、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）-Na2、EDTA-Na4、KIO3和1 mmol/L的NaF均对该酶有强烈的抑制作用。该酶水解焦磷酸四钠的最大反应速率为0.051 U/mg,米氏常数为0.54 mmol/L。