脱氧雪腐镰刀菌烯醇ELISA定量检测试剂盒的研制

研制了脱氧雪腐镰刀菌烯醇ELISA试剂盒,用于检测谷物粮食中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)。在抗DON单克隆抗体的基础上,用间接竞争酶联免疫吸附检测试剂盒各项指标。结果为:试剂盒最低检测浓度为20ng/mL,检测线性范围为50～400ng/mL,IC50103ng/mL。平均加标回收率>80%,批内变异系数小于10%,批间变异系数<15%。用试剂盒测定盲样,其结果与德国拜发试剂盒及免疫亲和柱-高效液相色谱检测结果无显著性差异。说明试剂盒指标符合相关技术要求,具有快速、灵敏、准确、方便等特点。     

直接竞争化学发光酶免疫方法检测克伦特罗残留

建立了克伦特罗的直接竞争化学发光酶免疫检测方法,并考察了方法的特异性、灵敏度。最佳反应条件为:包被抗原浓度为25 ng/mL;酶标抗体稀释80 000倍;0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.0),竞争反应时间30 min。方法的IC50为0.09 ng/mL;检出限为0.01 ng/mL;线性范围0.02⁷.59 ng/mL;对尿样、猪肉、肝脏以及饲料样品检测的平均回收率分别为94.5%7.59 ng/mL;对尿样、猪肉、肝脏以及饲料样品检测的平均回收率分别为94.5%⁹5.3%、90.7%95.3%、90.7%⁹4.1%,批内和批间相对标准偏差均小于15%。该方法与HPLC方法的相关性良好,说明其具有较高的灵敏度和特异性,可用于实际样品的检测。     

纳米均相时间分辨荧光免疫法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇方法的建立

目的:利用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)多克隆抗体,采用纳米均相时间分辨荧光免疫法测定技术(AlphaLISA)建立间接竞争DON定量检测方法.方法:DON-BSA包被发光微粒,生物素化羊抗兔抗体与包被有链霉素的感光微粒共同构成检测试剂,优化检测条件并评价检测性能.结果:该方法的灵敏度为0.007ng/mL,检测范围为0.007～100ng/mL,批内批间变异系数均<5%.不同样品添加回收实验:玉米、小麦、啤酒回收率分别为84%～110%、67%～100%、74%～100%.结论:DON-AlphaLISA是目前DON检测中最灵敏的方法之一,该分析方法稳定性好,可测范围宽,具有很好的应用前景.     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇ELISA定量检测试剂盒的研制*

研制了脱氧雪腐镰刀菌烯醇ELISA试剂盒,用于检测谷物粮食中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxyni-valenol,DON).在抗DON单克隆抗体的基础上,用间接竞争酶联免疫吸附检测试剂盒各项指标.结果为:试剂盒最低检测浓度为20 ng/mL,检测线性范围为50～400 ng/mL,IC<,50> 103 ng/mL.平均加标回收率>80%,批内变异系数小于10%,批间变异系数<15%.用试剂盒测定盲样,其结果与德国拜发试剂盒及免疫亲和柱-高效液相色谱检测结果无显著性差异.说明试剂盒指标符合相关技术要求,具有快速、灵敏、准确、方便等特点.     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟表位的2 种融合蛋白的表达及其在无毒酶联免疫吸附方法中的应用

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）的模拟表位（CDON）,是从噬菌体展示随机肽库中淘 选出来的七肽,可模拟DON与抗DON抗体结合。为了在酶联免疫吸附方法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）中用重组蛋白替代DON偶联物,以期开发出能代替偶联DON人工抗原的无毒检测DON的ELISA方法,通 过构建重组表达载体pGEX-CDON和pC89S4-CDON,并在大肠杆菌表达系统中分别表达和纯化GST-CDON和pⅧ- CDON融合蛋白,比较测定2 种融合蛋白与抗DON抗体的结合效果。ELISA方阵滴定结果显示：纯化的融合蛋白 具有良好的反应原性。在间接竞争性ELISA中,当以融合蛋白GST-CDON为包被抗原时,检测限为31 ng/mL,线 性范围为31～500 ng/mL,IC50为194 ng/mL,加标回收率为54.1%～65.4%,变异系数为6.28%～13.37%;当以融合 蛋白pⅧ-CDON为包被抗原时,检测限为15 ng/mL,线性范围为15～500 ng/mL,IC50为94 ng/mL,加标回收率为 81.7%～89.0%,变异系数为3.15%～7.55%。     

化学发光酶免疫法检测玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇

应用抗脱氧镰刀菌烯醇单克隆抗体,以辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系,建立了一种简便、快速、高特异性的间接竞争化学发光酶免疫法用于检测谷物中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇。所建立的方法分析灵敏度为10.7ng/mL,批内变异系数小于8.1%,批间变异系数小于12.8%,玉米的加标回收率为91.2%～99.5%,与其他常见真菌毒素未见明显交叉,所建立的标准曲线相关系数为0.9902,检测线性范围为12.9～163.7ng/mL,检测时间为40min。     

直接竞争化学发光酶免疫法检测猪肉中磺胺嘧啶

建立一种检测猪肉中磺胺嘧啶的简便、快速、高特异性的直接竞争化学发光酶免疫法。采用改良的过碘酸钠法制备酶标抗体,以辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢作为化学发光体系。经优化该方法检测条件为：利用柠檬酸缓冲液稀释抗原包被质量浓度为0.8μg/mL,酶标抗体2000倍稀释,竞争反应25min;所建立的方法分析灵敏度为2.96ng/mL,批内变异系数小于8.32%,批间变异系数小于13.4%,以猪肉为样品的分析回收率为75.6%～103.7%,与其他结构类似物未见明显交叉,所建立的标准曲线相关系数为0.9922、检测线性范围为4.14～244ng/mL、检测时间为25min,可在实际生产中应用。     

直接竞争化学发光酶免疫法检测谷物中的伏马菌素B1

建立1种检测谷物中伏马菌素B1的直接竞争化学发光酶免疫方法。该方法的最佳检测条件为:抗原包被质量浓度0.4μg/mL,酶标抗体3000倍稀释,竞争反应时间20min;检测限为0.13ng/mL,半抑制浓度(IC50)为1.43ng/mL,批内变异系数2.4%,批间变异系数9.2%,以玉米为样品的加标回收率达到100.2%～115.4%。谷物盲样的检测结果显示,该方法与酶联免疫吸附检测试剂盒、高效液相色谱检测结果的相关系数分别为0.9793、0.9851,三者之间无显著性差异,所建立的直接竞争化学发光酶免疫方法可用于谷物样品中伏马菌素B1的大规模快速筛查。     

日落黄酶联免疫试剂盒的制备及应用

为了快速准确检测食品中的日落黄,本研究通过羰基二咪唑法,将日落黄与载体蛋白偶联,并使用紫外光谱进行鉴定,结果显示日落黄检测抗原和免疫抗原成功合成;通过免疫小鼠制备了效价高达1:64000以上的抗日落黄单克隆抗体,研制了日落黄ELISA检测试剂盒。试剂盒性能检测分析结果显示,试剂盒标准曲线的线性检测范围为62.50～1000 ng/mL,检测限为1.50 ng/mL,检测灵敏度IC_(50)值为6.50 ng/mL;试剂盒中,用于检测的单克隆抗体对日落黄的交叉反应率为100%,对诱惑红有弱交叉反应,反应率为2%,与其他2种色素添加剂未见交叉反应;检测市售果汁、水果罐头和果冻类样品的批内、批间回收率分别为89.18%～101.13%、87.69%～97.90%,且批内、批间试验的相对标准偏差均小于10%,说明试剂盒具有良好的灵敏度和准确性,且操作方便快捷。本研究应用免疫学方法成功地制备了日落黄酶联免疫试剂盒,并检测了水果类制品中添加的日落黄,为大批量测定食品中日落黄含量提供了高效准确的实验方法。     

酶联免疫法检测克伦特罗残留量的质量控制

对酶联免疫法检测克伦特罗残留量的质量控制方法进行了探讨.应用酶联免疫法检测克伦特罗残留量可从克伦特罗试剂盒的检测下限、校正曲线的线性检验、精密度验证、以及添加克伦特罗标准品做回收率试验等方面来进行质量控制.结果表明,本方法的样品检测下限(定性检出)为0.03ng/mL,定量检测下限为0.1ng/mL;克伦特罗标准校正曲线Y=-0.1884X 0.4159在0.1～8.1ng/mL范围内具有良好的线性相关关系,相关系数为-0.9913;克伦特罗标准液的浓度分别为0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/mL时,变异系数分别为3.7%、5.3%、9.7%、9.2%、8.7%,在3.7%～9.7%的范围内;当克伦特罗标准品添加水平分别为0.5、1.0ng/mL时,平均回收率分别为84%、90%,在80%～100%的范围内.上述指标均符合残留分析质量控制的要求.     

呕吐毒素时间分辨荧光免疫层析法的建立与评价

构建并评价了呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)时间分辨荧光免疫层析法(TRFIA)。以Eu3+螯合物的纳米微球为荧光探针标记抗DON单抗,采用竞争抑制建立免疫层析定量方法,优化了微球与抗体标记量,检测的环境温度、反应时间、加样体积及缓冲体系;研究了方法的灵敏度、精密度及准确度。结果表明,每100 μL荧光微球结合纯单抗50 μg,最佳划膜浓度为1.0 mg/mL,最佳测定条件为室温(25±2)℃,10 min,加样体积100 μL,PBS (0.01 mol/L,pH7.2)的缓冲体系,方法的灵敏度为0.25 ng/mL,线性范围为0.5~25.0 ng/mL,玉米、小麦阴性样本(加标浓度200、500、1000、2000 μg/kg)平均加标回收率为91.4%~109.3%,6种典型样本经TRFIA与免疫亲和净化-高效液相色谱法(IAC-HPLC)同时测定DON含量,相关系数r达0.9754。TRFIA具有灵敏度高、速度快、定量准等技术特点,适用于谷物及制品中DON的快速定量。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇酶联免疫检测方法的建立

应用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体12D1建立了竞争间接ELISA方法,用于检测小麦、玉米中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),最低检出限为20ng/mL,检测范围为20￣460ng/mL。用蒸馏水提取掺合DON(250￣4000ng/g)的小麦样品,回收率为82.1%￣96.6%,变异系数为0.6%￣7.1%。     

Detection of deoxynivalenol in foods and indoor air using an array biosensor

Deoxynivalenol (DON), a mycotoxin produced by several Fusaruim species, is a worldwide contaminant of foods and feeds. Because of the potential dangers due to accidental or intentional contamination of foods with DON, there is a need to develop a rapid and highly sensitive method for easy identification and quantification of DON. In this study, we have developed and utilized a competitive immunoassay technique to detect DON in various food matrixes and indoor air samples using an array biosensor. A DON-biotin conjugate, immobilized on a NeutrAvidin-coated optical waveguide, competed with the DON in the sample for binding to fluorescently labeled DON monoclonal antibodies. To demonstrate a simple procedure amenable for on-site use, DON-spiked cornmeal, cornflakes, wheat, barley, and oats were extracted with methanol-water (3:1) and assayed without cleanup or preconcentration. The limits of detection ranged from 0.2 ng/mL in buffer to 50 ng/g in oats. The detection limit of DON spiked into an aqueous effluent from an air sampler was 4 ng/mL.     

超导体包被免疫荧光试纸法同时测定玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮适用性研究

为了能同时快速测定玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)两种毒素,采用基于超导体包被的免疫荧光快速定量检测技术,检测了多个玉米样品,结合加标回收率、稳定性、检出限、精密度等指标,并与液相色谱法的检测结果进行比较分析,评估方法的适用性。结果表明,超导体包被的免疫荧光试纸法检测DON含量在100～2 500μg/kg,检测ZEN含量在5～200μg/kg的范围内线性良好。DON在500～2 000μg/kg添加水平范围内,回收率为103.72%～108.17%,ZEN在50～150μg/kg添加水平范围内,回收率为97.81%～111.27%。该方法于液相色谱法检测结果对比,DON相对偏差在3.72%～8.17%,ZEN相对偏差在2.19%～11.27%,均低于液相色谱法允许偏差23%和15%,超导体包被的免疫荧光试纸法是一种有效、实用、快速、定量的分析方法,能满足同时检测玉米中DON和ZEN的要求。     

玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇双特异性抗体的制备及检测方法构建

玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）是粮食中常见的真菌毒素,长期的饮食暴露会对生物体造成严重危害。目前针对ZEN和DON同步免疫检测分别依赖各自对应的单克隆抗体,而传统单克隆抗体制备周期长、成本高。作者利用重组抗体表达技术在短时间内获得了可同时识别ZEN和DON的双特异性抗体（Bis-scFv）,并构建了基于Bis-scFv的间接竞争酶联免疫检测方法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,IC-ELISA）,获得ZEN和DON标准曲线的半数抑制质量浓度（IC₅₀）分别为20.64 ng/mL和132.29 ng/mL;Bis-scFv具有良好的特异性,与其他真菌毒素均无显著的交叉反应。同时,将IC-ELISA方法对玉米中的ZEN和DON进行加标回收实验,其回收率为86.02%～108.14%。本研究证明了所开发的Bis-scFv未来可应用于粮食样本中ZEN与DON的同步快速检测方法的开发。     

固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定酱油中脱氧雪腐镰刀菌烯醇

建立了固相萃取-气相色谱-质谱(SPE-GC-MS)检测酱油中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法。酱油样品采用乙腈-水(84∶16)提取,提取液经石油醚脱脂后过C18小柱净化,滤液吹干后经三甲基硅咪唑(1-Trimethylsilylim-idazole,TMSI)-三甲基氯硅烷(Chlorotrimethylsilane,TMCS)(10∶1)衍生5 min,最终GC-MS进行定性和定量分析。此方法对DON的线性范围为0.025～8.0μg/mL,相关系数(R2)为0.999 5,定量限(S/N=10)和检出限(S/N=3)分别为16.67 ng/mL和5 ng/mL。在添加水平为0.05、1.00和8.00μg/mL时,实际样品的平均回收率在82%～106%之间,相对标准偏差为5%～8%。此方法具有提取效率高,净化效果好,灵敏度高等优点,适用于酱油中DON的检测。采用此方法对市售的19种酱油进行检测,DON含量范围在0.04～1.24μg/mL间。     

恩诺沙星化学发光免疫分析试剂盒的研制

主要研制一种基于鲁米诺-辣根过氧化物酶体系的化学发光免疫分析试剂盒,用于检测食品中的痕量恩诺沙星残留。反应条件优化结果为:最佳包被抗原浓度为0.5ng/mL,最佳抗体稀释倍数为1:2000,药物稀释液为0.01mol/L的PBST溶液,一抗反应时间为30min。研究结果显示:本文研制的试剂盒的回归曲线方程是y=-22842x+172936,检测线性范围是0.024～2.76ng/mL,IC50为0.106ng/mL,对蜂蜜、牛奶、鱼肉和虾肉样本的添加回收率在96%～116%、90%～97%、92%～112%、86%～112%之间,批内和批间变异系数均小于15%,试剂盒在4℃下有效期为180d。     

对硫磷酶联免疫吸附分析方法的建立和评价

通过制备对硫磷的多克隆抗体,建立了对硫磷的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(icELISA)。通过活泼酯法将半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,获得免疫抗原和包被抗原。使用对硫磷抗血清,经优化条件参数建立了对硫磷的icELISA分析方法。该方法检测线性范围为3.39～533.05ng/mL,最低检测限为0.90ng/mL,对蔬菜样品和水样品的平均添加回收率为75.6%～127.4%,能用于实际样品中对硫磷的检测。