碳离子辐射对人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和P53、MDM2及P21表达的影响

研究^12C^6＋离子辐照对体外培养人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和P53、MDM2及P21表达的影响。采用0、1．0、2．0、4．0、6．0Gy^12C^6＋离子束辐照细胞,用克隆形成法观察细胞存活情况;同时在辐照24h后用流式细胞仪检测细胞周期的变化,Western-blot检测细胞中P53、MDM2及P21蛋白表达情况。结果发现,重离子辐照后细胞存活率显著下降;1．0Gy、4．0Gy和6．0Gy照射组发生G0／G1期阻滞,而2．0Gy照射组出现G2／M期阻滞;Western-blot结果显示细胞辐照后MDM2的57kD蛋白表达水平无明显变化,而76kD蛋白表达水平随辐照剂量逐渐上升;P53和P21蛋白表达水平随辐照剂量增高。以上结果提示不同剂量的^12C^6＋离子束照射可激活SMMC-7721细胞不同的细胞周期检测点,其中G0／G1期阻滞与P53和P21蛋白以及MDM2截短体76kD蛋白的表达水平升高有关。     

槲皮素促进电离辐射引起的衰老细胞发生凋亡

研究槲皮素对10 Gy的X射线及碳离子束辐照后衰老的人眼基底脉络膜黑色素瘤细胞系92-1凋亡发生及相关蛋白表达水平的影响。采用流式细胞术及衰老相关半乳糖苷酶检测试剂盒检测92-1细胞经10 Gy的X射线及碳离子束辐照后细胞凋亡及衰老情况。通过Cell counting kit-8(CCK8)法检测槲皮素对92-1细胞增殖活力的影响并结合细胞凋亡检测筛选槲皮素作用浓度。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测不同处理后92-1细胞的凋亡比例。采用蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3的表达水平。结果表明,92-1细胞经10 Gy的X射线或碳离子束辐照后3 d,细胞出现明显的衰老表型,凋亡发生率较低。CCK8法结合细胞凋亡筛选出50μmol/L作为后续处理浓度。辐照后立即或3 d后给予槲皮素处理能诱导细胞发生明显的凋亡,且Cleaved caspase-3表达水平显著上调。因此,槲皮素可促使辐照(10 Gy)后衰老的92-1细胞发生凋亡。     

Bcl-2/Bax基因表达对低剂量电离辐射诱导小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响

应用密度梯度离心法分离小鼠睾丸组织不同类型生精细胞，流式细胞术检测其细胞凋亡，免疫组织化学方法观察生精细胞Bcl-2和Bax蛋白表达。结果表明，0．025～0．2GyX射线全身照射后，小鼠睾丸组织生精细胞凋亡具有明显的细胞种类规律性。在较低剂量(0．025和0．05y)时，以精原细胞凋亡为主，随剂量增加(0．075—0．2Gy)逐渐累及精母细胞，并且前者凋亡率明显高于后者，很少累及精子细胞和精子。Bax蛋白表达主要见于精原细胞和精母细胞，前者阳性率高于后者，并且随照射剂量增加，阳性率逐渐升高，而精子细胞和精子阳性率较低；Bcl-2蛋白表达主要见于精子细胞和精子，而精原细胞和精母细胞阳性率较低。提示，Bcl-2和Bax基因表达的相互调节是低剂量电离辐射选择性诱导生精细胞凋亡的重要原因之一，这也为深入探讨低剂量电离辐射诱导生精细胞适应性反应的凋亡机制，提供了更深层次实验证据。     

低剂量X射线照射诱导体外EL-4淋巴瘤细胞凋亡适应性反应及其可能机制

用 X 射线照射离体 EL-4 淋巴瘤细胞,其诱导剂量(D1)为25-200mGy(剂量率12.5 mGy/min),攻击剂量(D2)为1.5 Gy(剂量率287 mGy/min),D1和D2间隔6 h.通过流式细胞仪检测其细胞凋亡百分数及其相关基因蛋白表达水平.其结果显示,当D1为25-100mGy,D2为1.5 Gy;或D1为75 mGy,D2为0.5-2.0Gy,与D2组比较,D1 D2组细胞凋亡百分数有显著意义降低.当D1为25-100 mGy,D2为1.5 Gy,与D2组比较,D1 D2组Bc1-2蛋白阳性百分数不同程度增加,Bax 蛋白有显著意义降低,Bcl-2/Bax 比值有显著意义增高;p53 蛋白不同程度降低.其结果提示,在 D1 为25-100 mGy,D2为0.5-2.0Gy,可诱导EL-4淋巴瘤细胞凋亡的适应性反应,其相关凋亡基因蛋白Bc1-2、Bax 和p53发生的改变,与其细胞凋亡明显相关,可能在其适应性反应的机制中起到重要的调节作用.     

小鼠脾淋巴细胞辐射死亡与凋亡之间的关系

探讨细胞凋亡在小鼠脾脏辐射损伤与重建中的作用及其机制,为急性放射病的防治提供依据.用原位末端标记、DNA电泳和免疫组化技术观察经2～8Gy不同剂量γ射线整体照射后,小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的动态变化过程和Bax、Bcl-2蛋白在其中的作用.结果表明,(1)照射后早期淋巴细胞凋亡率迅速增加,如6Gy照射后4h和1d凋亡率分别为对照值的4.9和9.7倍;凋亡率还随照射剂量的增加而迅速升高,照射后8h当照射剂量为2、4、6、8Gy时,凋亡率分别为对照值的3.7、5.4、6.2和8.3倍.(2)透射电镜观察表明,6Gyγ-线照射后,小鼠脾脏淋巴细胞出现早、中、晚期典型凋亡细胞的形态学特征.DNA凝胶电泳显示6Gy照射后4和6h,脾脏淋巴细胞出现特征的DNA梯形谱;末端标记法显示6Gy照射后4h凋亡率约为照前值的3.4倍.(3)照射后Bax、Bcl-2蛋白的异常表达证实两者在淋巴细胞凋亡的调控中起重要作用.细胞凋亡参与了小鼠脾脏辐射损伤与修复的全过程,Bax和Bcl-2蛋白对淋巴细胞凋亡的调控起重要作用.     

低聚壳聚糖对辐射损伤小鼠细胞凋亡的影响

从细胞凋亡角度探讨低聚壳聚糖提高辐射损伤动物存活率的机理。小鼠受到5 Gyγ射线照射后,检测骨髓淋巴细胞凋亡数、脾脏细胞凋亡相关基因和P53蛋白的变化。流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR技术检测凋亡基因,Western方法检测蛋白表达。与单纯照射组相比,低聚壳聚糖提高受照小鼠的存活率,降低骨髓淋巴细胞的凋亡细胞数量;下调凋亡相关基因Bax、caspas-3,上调Bc1-2,Bcl-2/Bax比值升高;抑制P53蛋白表达。低聚壳聚糖可能通过抑制P53蛋白表达,影响凋亡相关基因表达,从而抑制凋亡细胞的产生,有效提高受照小鼠存活率。     

N-乙酰半胱氨酸对HT22细胞辐射诱导氧化应激及增殖和凋亡的影响

为探讨N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)对辐射相关氧化应激和海马神经元HT22细胞的增殖及凋亡的影响。首先选用不同剂量(0、2、4、6、8、10、12 Gy)的X射线分别照射HT22细胞,筛选出最佳照射剂量(10 Gy),然后进行实验分组:空白对照(Control)组,单纯照射(RT)组,照射+NAC(RT+NAC)组,照射后继续培养24 h后,CCK-8法检测细胞增殖、AnnexinV/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡情况;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平以评估细胞内氧化应激程度,比色法测定细胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性,Western blot检测Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达变化。结果表明,(1)2 Gy的照射对细胞增殖的影响不明显,当辐射剂量大于2 Gy时,随着辐射剂量的增高,HT22细胞增殖率明显降低(p<0.05);辐射剂量达10 Gy时,细胞增殖抑制率接近50%,因此将10 Gy作为实验最佳辐射剂量。(2)给予10 Gy X射线照射前给予NAC预处理可明显增加HT22细胞的增殖率(p＜0.01)。(3)给予10 Gy X射线照射可明显增加细胞内ROS、MDA含量(p＜0.01),减少细胞内GSH含量和SOD的活力(p＜0.01),促进凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3的表达(p＜0.01),细胞凋亡率显著增加(p＜0.01);NAC可减少照射后细胞内ROS和MDA含量(p＜0.01),提高GSH水平及SOD活性(p＜0.01),显著减少凋亡蛋白的表达和细胞凋亡。以上结果表明NAC可抑制辐射相关氧化应激,减少辐射对HT22细胞增殖抑制,减少细胞凋亡。     

神经肽P物质对放射损伤皮肤成纤维细胞周期及凋亡的影响

为探讨神经肽P物质(substance P,SP)对放射损伤皮肤成纤维细胞凋亡及周期的影响,将人皮肤成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,HFF-1)分为0 Gy组(对照组)和12 Gy组、18 Gy组、12 Gy+SP组、18 Gy+SP组4个实验组。实验组经12 Gy、18 Gy的电子束照射,其中12 Gy+SP组、18 Gy+SP组于照射前1 h给予10^-7 mol/L SP干预。照射后48 h,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax表达情况。细胞周期检测显示,与0 Gy组相比,12 Gy和18 Gy组细胞G₂期百分比显著增加;18 Gy+SP组与18 Gy组相比,细胞G₂期百分比显著降低。细胞凋亡检测显示,与0 Gy组相比,12 Gy和18 Gy组细胞凋亡率显著升高;SP干预组(12 Gy+SP组、18 Gy+SP组)较照射组(12 Gy组、18 Gy组)的细胞凋亡率显著降低。实时荧光定量PCR对Bcl-2和Bax表达检测显示,与0 Gy组相比,12 Gy和18 Gy照射组细胞Bax基因表达显著升高,Bcl-2基因表达显著降低;SP干预组(12 Gy+SP组、18 Gy+SP组)较照射组(12 Gy组、18 Gy组),Bcl-2基因表达显著升高,Bax基因表达差异不显著。上述结果揭示,电子束照射可诱发人皮肤成纤维细胞的凋亡及细胞G₂期阻滞;SP可抑制放射损伤人皮肤成纤维细胞的凋亡及G₂期阻滞。     

12C^6＋离子束诱导HeLa细胞DNA损伤效应

本文研究了HeLa细胞经过12C^6＋离子柬辐照之后的DNA损伤效应,及辐照后p53激活的分子机制。运用中性单细胞电泳技术,检测了HeLa细胞经过4Gy12C6＋离子束辐照间隔0、3、6和12h之后DNA的损伤情况,及0.5、1、2和4Gy12C^6＋离子束辐照后即时的DNA损伤情况。同时运用细胞生长实时监测仪监测了HeLa细胞在经过0、0．5和1Gy也C6＋离子束辐照之后的生长变化,并运用AO／EB双染检测了辐照细胞24h后的凋亡情况。另外,利用8mmol／L的咖啡因[抑制ATM（ataxia-telangiectasia,mutated）和ATR（ATMand Rad3．relatedkinase）1和20μmol／L的wortmannin[抑制ATM和DNA—PK（DNA-dependent protein kinase）】处理HeLa细胞后再进行1Gy12C^6＋离子束辐照,通过westernblot检测p53的表达。结果显示,12C^6＋离子束辐照可造成HeLa细胞的DNA损伤,损伤随剂量升高而升高但随测定间隔时间降低,诱导HeLa细胞发生凋亡;而且辐照后p53表达升高。结果证明12C^6＋离子束辐照可造成HeLa细胞的DNA损伤并诱导损伤修复及凋亡等效应,损伤效应相关因子p53被激活,并且激活依赖于ATM。     

致死剂量γ射线照射小鼠淋巴结淋巴细胞凋亡动力学及其与相关蛋白表达的关系

用原位末端标记、原位杂交和碱磷酶免疫组化技术,观察致死剂量γ射线照射小鼠淋巴结淋巴细胞的凋亡动力学变化,及其与Bax、Bcl-2和Bcl-XL表达的关系。结果表明,照射后24h淋巴结淋巴细胞凋亡指数迅速升高,在6—12Gy范围内与照射剂量呈正比,≥15Gy照射后变化不明显。6Gy照射后24h,淋巴细胞凋亡达高峰,尔后开始降低;然而直至照射后6个月和12个月,凋亡指数仍明显高于对照组。6Gy照射后24h,淋巴细胞Bax蛋白表达即出现升高,当剂量为12Gy时达到峰值,15Gy和20Gy照射后未观察到这种剂量效应关系。而Bcl-2和Bcl-XL蛋白表达在照射后24h明显下降。bax和bcl-2mRNA的表达显示出相似趋势。以上结果显示,≤12Gy照射后细胞凋亡是淋巴细胞的重要死亡方式。照射后Bax的上调及Bcl-XL的下调在致死剂量照射引起的淋巴细胞凋亡调控中起重要作用。     

X射线辐照对CAL-27细胞株microRNA表达谱影响的生物信息学分析

选用生长状态良好的人舌鳞癌CAL-27细胞用于实验,X射线辐照至吸收剂量为2 Gy后,通过细胞克隆成形实验检测CAL-27细胞株的存活率,流式细胞技术检测细胞凋亡率;为研究其损伤机理进一步运用高通量测序技术(High throughput sequencing technique,Hi Seq)进行测序,分析吸收剂量为2 Gy的受照组CAL-27细胞miRNA的表达变化,并对其靶基因进行基因分类(Gene ontology,GO)和通路分析。结果表明:吸收剂量为2 Gy的受照组CAL-27细胞克隆存活率为59%(p0.05),细胞凋亡率为47.5%(p0.05);吸收剂量为2 Gy的受照组CAL-27细胞中共有21个已知miRNAs表达差异,其中有18个miRNAs表达上调,3个miRNAs表达下调;在靶基因GO生物学功能分析中,靶基因在生物学过程、细胞组分和分子功能中各有23个条目、18个条目和20个条目;通过KEGG数据库分析筛选出了18条信号通路,如嗅觉传导通路、细胞因子受体交互通路、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号通路等(p0.05)。结果提示,X射线辐照至吸收剂量为2 Gy时影响了人舌鳞癌CAL-27细胞miRNA表达谱,其机理可能与MAPK信号传导通路有关,这将为研究相关miRNA在舌鳞癌放射治疗中的分子生物学机理并寻找其标志基因打下一定基础。     

放射性核素89Sr诱发K562癌细胞凋亡的放射毒理效应的分子机理研究

采用分子病理和定量病理技术研究放射性核素89Sr诱导的K562癌细胞凋亡、剂量效应关系和重要相关基因bcl-2和bax在其中的表达.结果表明,K562细胞经89Sr作用达6h和24h,提取DNA,琼脂糖凝胶电泳图谱上出现典型的"阶梯状"区带,伴有"拖尾",而对照组未见"阶梯状"区带;荧光双标记流式细胞仪法定量检测见89Sr作用6、9、12、24和48h后,K562细胞凋亡率、K562细胞坏死率均较对照组有明显的升高(p<0.01).免疫组织化学染色显示,对照组K562细胞中bcl-2 、bax均有表达,bcl-2表达阳性细胞率82.8%,bax表达阳性细胞率44.4%, bcl-2/bax比值1.86,89Sr作用24h后的K562细胞中, bcl-2表达阳性细胞率31.4%,bax表达阳性细胞率38.2%, bcl-2/bax比值0.82,与对照组相比,差异具有显著性(p<0.05);结果显示,放射性核素89Sr照射K562细胞后,细胞凋亡与细胞坏死并存,且89Sr诱导K562细胞的凋亡可能是通过bcl-2 表达蛋白降低,bcl-2/ bax比值下降而调控的.     

青蒿素与蒿甲醚对人鼻咽癌CNE-1细胞放射增敏作用的比较研究

为了比较青蒿素(Artemisinin)和蒿甲醚(Artemether)对人鼻咽癌CNE-1细胞放射增敏作用的差异,取指数生长期的人鼻咽癌CNE-1细胞,采用细胞克隆形成法分别检测青蒿素和蒿甲醚对CNE-1细胞生长的抑制效应,比较两种药物抑制效应的差异性,并确定实验的药物浓度;将人鼻咽癌细胞分为对照组、单纯药物组、单纯照射组及联合治疗组。单纯药物组、联合治疗组分别分为青蒿素组和蒿甲醚亚组,射线照射剂量为0、2、4、6和8Gy,采用多靶单击数学模型拟合细胞存活曲线,取放射增敏比(SER)为达到相同生物效应时,单纯照射的剂量与联合治疗组的剂量之比。实验结果表明,两种药物对细胞的抑制作用均随着药物浓度的提高而增强,存在剂量依赖关系。青蒿素对CNE-1细胞的抑制作用高于蒿甲醚,测得青蒿素放射增敏比(SER)为1.272,蒿甲醚SER为1.481,表明蒿甲醚较青蒿素对人鼻咽癌CNE-1细胞具有更强的放射增敏作用。     

中子和γ射线照射对小鼠骨髓造血细胞死亡方式的探讨

为探讨中子和γ射线照射后小鼠骨髓造血细胞的死亡方式及其意义,采用不同剂量中子和60Co γ射线全身照射350只BALB/c小鼠,通过光镜、电镜、流式细胞术、原位末端标记和DNA凝胶电泳等观察造血细胞凋亡与坏死情况.研究发现,中子照射后小鼠骨髓中坏死和凋亡的造血细胞均明显增多,5.5Gy组以坏死为主,而γ射线照射后则以凋亡为主,且呈剂量相关性.凋亡的细胞表现为核染色质浓缩、边移,呈半月型、环状或不规则状,凋亡小体形成,电泳下见DNA梯状图谱.坏死的细胞表现为核肿胀、溶解,线粒体膜、核膜等膜性结构破坏.2.5-5.5Gy中子及5.5-12Gyγ射线照射可使骨髓造血细胞死亡方式不同:中子照射以凋亡与坏死并存,5.5Gy组以坏死为主;而γ射线照射则以凋亡为主.     

电离辐射对人肝细胞MXR7基因表达的影响及放射性工作人员外周血MXR7的表达分析

为探讨电离辐射对人正常肝细胞及外周血MXR7基因表达的影响,利用⁶⁰Co γ射线对培养的人肝细胞HL-7702进行照射,同时,抽取某工厂放射性工作人员外周血,通过实时荧光定量PCR对照射后的各剂量组肝细胞及放射性工作人员外周血MXR7基因的表达情况进行检测分析。结果表明,电离辐射可诱导人正常肝细胞MXR7基因的差异表达,且基因表达与照射剂量存在一定的剂量相关性;放射性工作人员外周血MXR7基因表达与非放射性工作人员相比显著升高。     

浓缩铀诱发免疫细胞凋亡的形态观察及IL-2和IL-6的防护作用

对浓缩铀２３５Ｕ内照射人淋巴细胞白血病细胞株Ｍｏｌｔ４细胞和巨噬细胞株Ａｎａ１细胞诱发的细胞凋亡及细胞因子的防护作用进行了研究。实验中估算了２３５Ｕ在不同阶段培养细胞中的辐射累积吸收剂量。通过荧光显微镜形态观察，发现免疫细胞在受２３５Ｕ辐照后，可诱发明显的以核断裂和核固缩为特征的细胞凋亡。微观放射自显影研究显示，２３５Ｕ可迅速被免疫细胞吞噬，在细胞内以吞噬小泡的形式均匀地弥散于胞浆和胞核内。研究发现，ＩＬ２和ＩＬ６这两个细胞因子对由２３５Ｕ诱发的免疫细胞ＤＮＡ链断裂具有显著的防护作用。研究结果对于临床上寻找提高内照射放射治疗病例的免疫功能措施，具有一定的价值。     

不同LET辐射对HepG2肝癌细胞的辐射敏感性与周期阻滞的影响

本工作研究不同LET射线辐照对HepG2肝癌细胞辐射敏感性、周期进程和凋亡的影响,为重离子治疗癌症的临床应用积累基础数据.以0、0.5、1、2、4、8Gy剂量的12C6 离子及X射线分别照射处于指数生长期的HepG2细胞,用克隆形成率测定细胞辐射敏感性,通过流式细胞术测定细胞DNA含量以确定各时相细胞的比例及细胞凋亡情况.实验结果显示,12C6 离子辐照所致的HepG2细胞存活率明显低于X射线.随着吸收剂量的增加和修复时间的延长,12C6 离子能导致更显著的细胞S期阻滞、G2/M期阻滞延迟和细胞凋亡.说明与X射线相比,12C6 离子辐照能更有效地杀伤HepG2肝癌细胞并诱导其凋亡.     

电离辐射对小鼠小肠和结肠细胞凋亡的影响

观察不同剂量ｒ射线照射对小鼠小肠和结肠细胞凋亡水平的影响。６０Ｃｏｒ射线全 身照射 ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠;剂量分别为 １、 ６、 １２Ｇｙ,于照射后 ２４ｈ内分批取材,常规石蜡包埋, ＨＥ染色, Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜下观察辐射诱导小肠和结肠细胞凋亡的情况。结果表明：正常小鼠小 肠细胞有自发的凋亡现象,平均每个隐窝的凋亡细胞数为０．０３８±０．０５９个,结肠在正常情况下没 有细胞凋亡发生;不同剂量ｒ射线照射后小肠隐窝细胞凋亡数目明显增加（ｐ ＜０．０５）,其中 １Ｇｙ 照射组凋亡峰在照射后 １２ｈ明显, ６Ｇｙ和 １２Ｇｙ组分别在照射后 ２４ｈ和 ６ｈ凋亡细胞最多。结 肠未见或偶见凋亡细胞;各照射剂量组及照射后不同时间（照射后 ６、 １２、 ２４ｈ）组小肠隐窝细 胞凋亡数较相应结肠组显著增加（ｐ＜０．０５）。说明在电离辐射的情况下,小肠较结肠能更有效的 清除辐射损伤的细胞,而后者在体内的蓄积可能与以后的肿瘤发生有关。     

抑制HSP90对缺氧肿瘤细胞辐射敏感性的影响

为研究抑制HSP90对缺氧模拟剂(CoCl2)处理的人宫颈癌Hela细胞的辐射敏感性影响,分别用不同浓度的CoCl2处理Hela细胞24 h进行模拟缺氧处理,用不同浓度的HSP90特异性抑制剂17-DMAG预处理细胞16 h,应用γ射线照射细胞,照射剂量分别为2、4、6和8 Gy,采用克隆形成实验观察细胞的存活率,用Western blot实验检测HIF-1α蛋白表达量变化,用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果显示:用CoCl2处理细胞可以诱导HIF-1α蛋白过表达;不同浓度17-DMAG处理组的Hela细胞在不同照射组间的存活率差异具有显著性(p<0.01);17-DMAG预处理缺氧Hela细胞后,HIF-1α蛋白表达随药物浓度增加受到显著抑制,细胞早、晚期凋亡率随药物浓度增加而增加。结果表明:17-DMAG预处理模拟缺氧细胞可增加细胞辐射敏感性并促进细胞凋亡,其机制可能是通过抑制HIF-1α蛋白表达而发挥作用。