地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌

以耐高温α 淀粉酶生产菌地衣芽孢杆菌染色体DNA为模板 ,通过PCR扩增耐高温α 淀粉酶基因 ,将扩增产物 1 9kb的DNA片段插入到pUC1 9质粒中 ,再转化大肠杆菌JM1 0 9,通过在淀粉平板上形成透明圈等方法筛选到一株阳性克隆菌株JM1 0 9(pUAM) ,其表达产物可分泌到培养基中 ,除去菌体的发酵液中每 1 0 0mL酶活可达到 2 7个单位。将发酵上清液浓缩后用冷无水乙醇分级沉淀 ,所得样品进行SDS PAGE分析 ,得到分子质量为 60ku的目的蛋白带。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

透明颤菌vgb基因在地衣芽孢杆菌中表达用于改良α-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶是淀粉加工与食品发酵工业上关键酶制剂之一。为了降低高温α-淀粉酶生产过程中所需要的高溶氧水平对设备的要求,进一步提高α-淀粉酶的生产性能,本研究构建同源整合载体pAX01-sacB-vgb,在地衣芽孢杆菌(B.licheniforms)CICC 10181染色体中表达增强摄氧的透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb)。发酵实验结果表明,在同等溶氧条件下,重组菌比野生菌生物量提高了45.8%,高温α-淀粉酶酶活提高了116.7%,具有良好的工业应用前景。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku,同核酸序列测定所推导的值相符。     

一株α-高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌产酶培养基的优化

从西藏当雄温泉附近的土壤中筛选到的一株分泌高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌B.licheninformis LT.该菌的原始的淀粉酶活为60 U.经优化培养基(黄豆粉1.5,玉米粉1.5, NaCl 1,K2HPO4 0.01, KH2PO4 0.01, CaCl2 0.4,司盘40 0.1,pH 10.0)在50 ℃、装液量10%、180 r/min的摇床培养72h后, 测得酶活105 U.     

极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

为探索极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WB600）中的高效分泌表达条件,对来源于枯草芽孢杆菌的9?种Sec分泌途径信号肽进行筛选,结果显示信号肽YfkN的引导分泌效率最高。在此基础上,为进一步优化PFA的分泌表达,对信号肽YfkN的Ile3和Gln4进行饱和突变,并比较不同突变体的引导分泌效率。结果表明突变体I3G/Q4R的引导分泌效率最高,重组枯草芽孢杆菌的胞外α-淀粉酶活力高达715?U/mL。重组α-淀粉酶PFA的最适反应pH值为5.0,最适反应温度为100?℃,于100?℃的半衰期长达13?h,并且不依赖于Ca2＋。结果表明,采用信号肽I3G/Q4R,极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达,这有利于其在淀粉液化工艺中的应用。     

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

酸性α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现酸性α-淀粉酶基因的高效表达,将本实验室已经克隆得到的去信号肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌WB600宿主中进行表达,成功的构建了表达菌株pHT43-amy/WB600。在初始菌浓度OD600为0.8时加入终浓度为0.9 mmol/L的IPTG,诱导6 h的条件下测得酶活力为1 230 U/mL,又由于宿主菌WB600外分泌蛋白较少,因此具有明显的生产优势。     

α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

α-淀粉酶基因经改造后,克隆到穿梭质粒pBE2中。在α-淀粉酶基因的上游连接枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR),构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,转化蛋白酶三缺陷枯草芽孢杆菌菌株DB403。含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外,表明sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR)能很好的将枯草芽孢杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性及生物学活性。     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。     

基于液滴微流控的产α-淀粉酶地衣芽孢杆菌高通量筛选

α-淀粉酶广泛应用于食品、纺织等行业,市场潜力巨大.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是 α-淀粉酶的主要生产菌株,但由于存在产酶能力低等问题,不能满足工业需求.为了获得高产 α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌生产菌株,将酶活性与荧光信号偶联,通过将高活性单细胞制备、液滴包埋以及筛选条件等参数优化,建立...     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。     

碳源对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶的影响

研究可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖3种主要碳源对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶活力、细菌浊度及其发酵培养过程中培养基pH值变化的影响.结果表明,枯草芽孢杆菌在摇床发酵试验中,当发酵时间超过54 h酶活力基本达到最高且保持不变.以可溶性淀粉为碳源时最佳,枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶酶活力最高为(114.5±2.3) U/mL,细胞浊度为2.342±0.023;其次是葡萄糖和蔗糖,最高酶活分别为(75.6±2.1),(72.2±1.2) U/mL,细胞浊度分别为2.515±0.031,2.421±0.044.可见枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶受淀粉的诱导,受蔗糖及葡萄糖的阻扼作用.     

浓香型酒醅中一株耐热地衣芽孢杆菌产淀粉酶和蛋白酶培养条件的优化

以浓香型酒醅分离得到的一株地衣芽孢杆菌为试验菌株.以培养温度、培养时间、转速作为主要影响因素,通过单因素试验和正交试验对该菌株产淀粉酶和蛋白酶的条件进行优化,该菌株同时产淀粉酶和蛋白酶的最优条件为:培养温度40℃,培养时间36h,培养转速150r/min,此条件下,蛋白酶活力达到最高的51.84U/mL,淀粉酶活力达到...     

地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的制备

提出了一种地衣芽孢杆菌β 甘露聚糖酶制备的工艺。结果表明 :在设定的操作条件下 ,6 6L自控罐发酵酶活可达 2 6 0u/mL。发酵液用AlCl3与壳聚糖絮凝预处理后 ,絮凝体喷雾干燥可制成 90 0u/g的酶粉 ,适合饲料和造纸工业使用 ;絮凝上清液先以平均截留分子质量5万的中空纤维聚砜膜分离 ,透过液再用平均截留分子质量 1万的中空纤维聚砜膜浓缩后 ,喷雾干燥可制成 110 0 0u/g的酶粉 ,适合食品和医药工业使用。以上工艺酶活总收率 88% ,并易于工业放大     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其发酵条件优化

以枯草芽孢杆菌为表达系统,以中温α-淀粉酶为目标蛋白,研究了启动子和信号肽对外源蛋白表达分泌的影响。分别选取了4种启动子以及8种信号肽来进行筛选,结果表明,启动子PApr E的强度最高,信号肽SPnpr E的分泌效率最好。针对重组菌株1A751Q31进行系统的发酵优化,在72 h发酵液中α-淀粉酶酶活达到380U/m L。在7.5 L发酵罐中进行放大实验,发酵液中α-淀粉酶酶活最高达到853 U/m L。以上研究表明,α-淀粉酶适合在枯草芽孢杆菌中进行表达,同时表明枯草芽孢杆菌是良好的异源蛋白表达系统。     

嗜热放线菌海藻糖合成酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

海藻糖合成酶可将麦芽糖异构化为海藻糖,是海藻糖酶法生物转化的中心酶制剂。为了实现海藻糖合成酶在食品安全型表达宿主中高效生产,进而应用于食品级海藻糖的酶法合成,构建了革兰氏阳性菌重组表达质粒并转化入地衣芽孢杆菌。重组质粒携带了来自于嗜热放线菌Thermomonospora curvata海藻糖合成酶的编码基因,在地衣芽孢杆菌木糖异构酶启动子及其阻遏蛋白的介导下表达,胞内海藻糖合成酶发酵活力为12.1 U/m L。考察了不同培养条件对重组菌生长和产酶的影响,结果显示质量分数4%的麦芽糊精和质量分数0.4%的豆饼粉分别为产酶适宜的碳源和氮源;菌体培养10 h后加入终质量浓度为1 g/d L的诱导剂,于37℃诱导12 h后重组菌产酶最高达到23.7 U/m L。     

重组β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其在糖化反应中的应用

β-淀粉酶(β-amylase,AmyM)是一种重要的工业用酶,广泛应用在啤酒酿造、制糖等行业中.本研究利用Bacillus megatherium DSM 319来源的β-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6051?10)中分泌表达.首先,构建不同单启动子和双启动子介导β-淀粉酶...     

特香型白酒大曲中一株耐热产淀粉酶地衣芽孢杆菌的分离和鉴定

耐高温的细菌是中高温大曲的重要优势菌,为了鉴定特香型白酒大曲的功能细菌,从特香型大曲火圈层中分离筛选到1株具有水解淀粉活性的耐高温细菌菌株ZRF-1.本试验结合扫描电镜鉴定菌株形态、生理生化特性鉴定和gyrB基因序列同源性分析鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌.利用该菌株模拟大曲制作工艺固态发酵产生吡嗪类风味化合物四甲基吡嗪、2...     

地衣芽胞杆菌α-淀粉酶耐热耐酸突变体的酶学性质

地衣芽胞杆菌α-淀粉酶(Bacillus licheniformisα-amylase,BLA)的耐热耐酸性特征,是其在淀粉酶法加工中最重要的应用属性。在通过人工进化获得BLA突变体V-2的基础上,该研究对其酶学性质进行了较全面的分析。突变体V-2在80℃和pH 5. 5下表现出最高酶活力,最适作用温度和pH较BLA提高了10℃和降低了0.5～1.0个pH值,其耐热性和耐酸性显著优于BLA,该突变体的酶活力对金属离子特别是Ca²⁺的依赖性显著降低,该酶对淀粉水解作用明显优于BLA,其催化效率是BLA的33倍。