1,3-丙二醇发酵过程中底物抑制及其对策的研究

研究了底物甘油浓度对Klebsiellapneumoniae发酵生产 1 ,3 丙二醇的影响 ,并通过实验确定了最佳的初始甘油浓度和甘油开始对产物生成产生抑制作用的浓度。针对底物抑制现象 ,提出了菌种驯化和流加甘油发酵两种解决途径。结果表明 :采用原始菌株发酵 ,适宜的甘油初始浓度为 642 .4mmol/L ,此时 1 ,3 丙二醇浓度和转化率分别可达 2 60mmol/L和 0 .492mol/mol;在较高甘油初始浓度 (789mmol/L)的情况下 ,经驯化培养获得的耐底物抑制菌株 ,可将最终 1 ,3 丙二醇浓度和转化率分别提高到 30 0 .9mmol/L和 0 .530mol/mol;采用流加甘油发酵工艺 ,1 ,3 丙二醇浓度和转化率分别可提高到 397.7mmol/L和 0 .62 5mol/mol。     

两段双底物发酵生产1,3–丙二醇

利用Klebsiella pneumoniae生长与催化耦合的特点，将好氧生长与厌氧转化两个过程耦合，开发了两段双底物发酵生产1,3-丙二醇的新工艺，并对其工艺特点进行了初步研究. 结果表明，采用两段双底物发酵工艺，发酵过程菌体浓度明显高于传统的厌氧转化工艺，OD650最大值达到9.37，发酵60 h, 1,3-丙二醇的浓度达到50.16 g/L，生成速率达0.836 g/(L×h)，比传统工艺提高了45%.     

葡萄糖作辅助碳源对klebsiella pneumoniae发酵生产1,3-丙二醇的影响

在Klebsiella pneumoniae发酵甘油生产1,3 丙二醇的种子培养及发酵实验中,考察了葡萄糖作辅助碳源对菌体生长及1,3 丙二醇生成的影响. 结果表明,在种子培养期,以葡萄糖和甘油为混合碳源可缩短种子培养周期;在批次发酵和流加发酵中,葡萄糖作辅助碳源可使1,3 丙二醇产率及得率明显提高,但不同的葡萄糖加入方式对产率及得率促进的效果不同. 在初始发酵培养基中添加5 g/L葡萄糖、并在4 40 h进行葡萄糖与甘油混合液连续流加的条件下,1,3 丙二醇浓度、产率及得率较单一甘油为底物的流加发酵结果分别提高41.2 , 38.6 和8.3 .     

克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶发酵条件研究

研究了克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶(甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶)的发酵条件。研究各种碳源、无机氮源、有机氮源及无机盐对产酶的影响,应用均匀设计、神经网络和遗传算法优化发酵培养基组成,结果为(gL-1):甘油30、KCl 1.6、NH4Cl 6.7、CaCl2 0.28、酵母浸膏2.8。在温度37C、初始pH 7.0、摇床转速200rmin-1和接种量5%条件下,发酵24h,无细胞抽提液中甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶活力(U·mg-1)分别为9.16、18.72、0.48,发酵34h,发酵液中1,3-丙二醇(1,3-PD)最大浓度为7.96gL-1。代谢过程中关键酶酶活与1,3-PD峰值出现时间不一致,且提早于1,3-PD峰值的出现。此外,结果表明优化后的培养基去除了多种微量元素,克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶可以在微氧条件下进行。     

微生物发酵法生产1,3-丙二醇

微生物发酵法生产1,3-丙二醇(PDO)以可再生资源——淀粉(糖)为原料,具有操作简便、反应条件相对温和、副产物少、污染少且容易处理等优点。目前,直接利用糖生产PDO以降低微生物发酵成本的方法主要有3种:以葡萄糖为辅助底物;采用混合菌或两步法发酵;基因工程菌的构建。清华大学化工系利用二元醇可与乙醛反应生成缩醛的原理研究了PDO的分离、提纯工艺,并在两步发酵法生产甘油专利技术的基础上,进一步开发了将甘油发酵第二步厌氧耗糖过程与PDO厌氧发酵耦合进行的新工艺。     

若干因素对发酵法生产1,3-丙二醇的调控作用

利用一株新筛选的克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae ZJU 5205)对发酵法生产1,3-丙二醇进行了研究,考察了 pH、溶氧及添加辅助底物葡萄糖对发酵过程的调控作用。实验结果表明,相比于未调控 pH 发酵,恒定 pH 值发酵得到的菌体浓度明显增高,甘油消耗加快,1,3-丙二醇的最终浓度以及甘油到丙二醇的转化率(Y_(P/S))明显提高,分别达16.39g/L和0.51mol/mol;厌氧发酵时的菌体浓度和甘油消耗速率均高于微氧发酵,但1,3-丙二醇最终浓度和转化率低于微氧发酵;添加葡萄糖为辅助底物能够有效促进菌体生长,但1,3-丙二醇最终浓度和转化率却低于以甘油为单一底物时的发酵结果。     

微生物发酵法生产1,3-丙二醇研究进展

综述了世界上微生物发酵法生产1,3-丙二醇(PDO)的发酵菌种、发酵工艺、基因工程产物的提取的研究进展,并介绍清华大学化工系在发酵法生产甘油专利技术的基础上,进一步开发了二步发酵由葡萄糖生产PDO的新工艺,并将电渗析脱盐技术引入了PDO的后提取工艺中。通过5000L发酵罐的中试实验表明,发酵液中PDO平均浓度可达62g/L,PDO对甘油摩尔得率0.6,后提取收率80%。     

蔗糖与葡萄糖作辅助碳源对重组Klebsiella pneumoniae发酵生产 1,3-丙二醇的影响

实验研究了重组Klebsiella pneumoniae批式发酵生产1,3-丙二醇过程中辅助碳源蔗糖与葡萄糖对发酵过程的影响,对发酵工艺进行了放大,并对流加策略进行了优化. 结果表明,葡萄糖为发酵生产1,3-丙二醇的辅助碳源优于蔗糖;以重组Klebsiella pneumoniae为菌种,以葡萄糖为辅助碳源,采用指数流加策略,30 L发酵罐中1,3-丙二醇的产量最高达85.2 g/L,产率达0.63 mol/mol,比单纯以甘油为碳源分别提高37.35%和25.00%.     

氧对Klebsiella pneumoniae产1,3-丙二醇代谢的影响

考察了氧对Klebsiella pneumoniae发酵产1,3-丙二醇(PDO)代谢的影响. 研究结果表明,在厌氧或供氧条件下,K. pneumoniae都能利用甘油产PDO. 起始甘油浓度20 g/L,发酵时间4 h,在充分供氧条件下,PDO产量仅为1.1 mmol/L;但在微量供氧条件下,PDO产量为16 mmol/L,是厌氧发酵时的1.28倍. 在微量供氧条件下,调控PDO合成的关键酶甘油脱氢酶、甘油脱水酶及1,3-丙二醇氧化还原酶的活性分别为7.28, 1.14, 0.52 U/mg,高于厌氧或充分供氧条件下的相应酶活性. 氧对细胞内NADH的合成也有影响,厌氧及微量供氧条件下菌体内NADH含量分别为3.78及3.72 μmol/g (DCW),高于充分供氧发酵时的0.85 μmol/g (DCW).     

微生物发酵法中试生产1,3-丙二醇

以甘油为原料,利用克雷伯氏菌进行了发酵罐容积规模分别为1 m3和20 m3的发酵法1,3-丙二醇生产的中试研究。试验结果表明:1m3和20m3的发酵罐最终发酵液中1,3-丙二醇平均质量浓度分别达到了74.6 g/L和63.9 g/L,1,3-丙二醇相对于甘油的得率分别为61.2%和49.9%。采用发酵液醇沉预处理、再精馏的专利技术可分离得到纯度大于99%的1,3-丙二醇产品,分离收率大于85%,产品质量达到了聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)聚合反应的要求。成本分析表明,生物法生产1,3-丙二醇技术是经济可行的。     

有氧条件下Klebsiella pneumoniae发酵生产1,3-丙二醇的研究

探讨了有氧条件下利用Klebsiella pneumoniae发酵生产1,3-丙二醇的可能性,研究了通气量、初始底物浓度、pH和3-羟基丙醛等因素对发酵过程的影响.当空气通量为0.25vvm时,1,3-丙二醇的得率和生产强度与厌氧时相近.有氧条件下,当初始甘油质量浓度大于50g/L时,发酵中后期出现3-羟基丙醛的长期积累,甘油不能消耗完全.控制pH为7.75～8.00可以促进3-羟基丙醛的转化使甘油完全消耗.     

醛脱氢酶基因敲除对克氏肺炎杆菌合成1，3-丙二醇的影响

利用Klebsiella pneumoniae厌氧发酵甘油生产1,3-丙二醇时，一部分甘油通过氧化代谢途径大量合成副产物乙醇，降低了1,3-丙二醇的得率.醛脱氢酶ALDH是乙醇合成途径的关键酶之一，其催化作用不仅消耗了大量甘油，还将还原型辅酶NADH氧化为NAD⁺，降低了同为NADH依赖型的1,3-PD合成途径的效率.本文以醛脱氢酶ALDH为改造目标，以K.pneumoniae为宿主，通过同源重组技术在K.pneumoniae M5aL的ALDH基因中成功地插入了四环素抗性基因，经抗性筛选和基因水平鉴定，得到两株ALDH基因敲除的重组菌0623-1hb及0623-1hc.本文研究了这两株重组菌的生长代谢特性，结果表明两株重组菌的ALDH酶活基本检测不到，菌体生长受到明显抑制，乙醇合成浓度比出发菌株K.pneumoniae M5aL降低了43%～53%，1,3-PD合成浓度及摩尔得率分别提高了27%～42%和19%～24%.     

1,3-丙二醇发酵条件的探索

对筛选得到的一株生产1, 3-丙二醇性能比较好的克雷伯氏肺炎杆菌PK2的发酵条件进行了探索,确定了最佳发酵温度为37℃. 考察了C, N, P单因子对发酵的影响,通过正交实验确定了培养基的C, N, P最佳配方及pH. 甘油的转化率可达46.7%.     

3-羟丙醛对Klebsiella pneumoniae发酵产 1,3-丙二醇的影响及其调控

中间产物3-羟丙醛在发酵液中的积累对Klebsiella pneumoniae细胞生长及1,3-丙二醇的合成有显著的抑制作用,而调节发酵的起始甘油浓度及控制发酵pH值可调控发酵液中3-羟丙醛的积累.当起始甘油质量浓度分别为20、30、50、70g/L的批式发酵中,发酵液中3-羟丙醛的积累的高峰分别为4.31、6.87、11.48及13.49mmol/L,当起始甘油质量浓度大于50g/L时,3-羟丙醛在到达积累高峰后不能被菌体有效转化,在发酵后期维持较高浓度,抑制了细胞生长及1,3-丙二醇的合成,发酵不能继续进行.控制发酵pH值为7.75～8.0可促进发酵液堆积的3-羟丙醛被迅速转化.在流加发酵中起始甘油质量浓度采用30g/L,发酵pH值控制为7.75条件下,发酵32 h,1,3-丙二醇质量浓度可达37.16g/L,1,3-丙二醇的生产强度和质量得率分别达到1.16g/(L·h)和52.66%.     

能量驱动对Klebsiella pneumoniae发酵甘油合成1,3-丙二醇的影响

考察了外加能量对Klebsiella pneumoniae合成1,3 丙二醇的影响,结果表明,外加0.6 0.8 g/L三磷酸腺苷 ATP 可以有效促进Klebsiella pneumoniae发酵甘油的还原代谢,1,3 丙二醇产量提高了50 70 ,得率在发酵后期仍能维持在较高水平. 利用休止细胞研究了甘油脱水酶催化失活后能量刺激复活的情况,结果表明外加三磷酸腺苷(ATP)对休止细胞中甘油脱水酶的复活有明显的驱动作用,经多次失活/驱动复活后甘油脱水酶活性可维持不变.