人巨细胞病毒gB基因真核表达载体的构建与鉴定

目的　克隆人巨细胞病毒 (HCMV)gB基因并构建真核表达载体。方法　根据Genebank中HCMV核苷酸序列设计引物 ,并在引物的 5′端分别加入BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶位点 ,特异性扩增gB编码基因片段。TA克隆后经双酶切、PCR、测序等鉴定重组质粒 ,再经双酶切、连接构建含HCMVgB编码基因的真核表达载体 ,转染COS7细胞 ,通过间接免疫荧光法 (IFA)检测该重组真核表达载体在COS7细胞中的表达。结果　重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成大小为 5 0kb与 2 7kb的片段 ,表明表达载体pcDNA3 1中插入了HCMVgB基因片段 ,测序结果表明读码框正确。重组表达载体pcDNA3 1 gB转染COS7细胞后 ,经IFA检测胞浆中可见黄绿色荧光。结论成功构建了pcDNA3 1 gB真核表达载体 ,并可在COS7细胞中表达     

产气荚膜梭菌α-β_2-β_1融合基因的构建及表达

目的构建产气荚膜梭菌α-β2-β1融合蛋白基因表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法利用PCR技术,从含α毒素基因的质粒pXCPA02中扩增出α毒素基因,经NcoⅠ酶切,回收0·95kb的α基因片段,再与经NcoⅠ酶切并含融合基因β1-β2的质粒pXETB1B2连接,获得重组质粒pXETAB2B1,经NcoⅠ、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定,并对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组质粒pXETAB2B1含有α-β2-β1融合基因。表达产物相对分子质量约为95000,并可被特异性抗体识别。结论已获得高效表达α-β2-β1的重组菌株。     

重组人凝血因子Ⅶ在Flp-In-CHO细胞中的表达及鉴定

目的利用Flp/FRT位点特异性重组技术,在Flp-In-CHO细胞中表达重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ),并进行鉴定。方法用限制性内切酶EcoRⅠ和EcoRⅤ分别双酶切质粒pT-FⅦ与表达载体pcDNA5/FRT/TO,将回收的目的基因片段和载体片段连接,构建重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ,并与辅助质粒pOG44共转染Flp-In-CHO细胞,经400μg/ml潮霉素B压力筛选,获得抗性细胞株。采用PCR、RT-PCR、Western blot和PT等方法对筛选出的细胞株分别进行基因组水平、mRNA水平、表达水平和蛋白活性的鉴定。结果重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;筛选出9株抗性细胞;外源基因FⅦ定点整合到Flp-In-CHO细胞基因组中并得到表达;重组蛋白表现出与血浆FⅦ相一致的促凝活性。结论利用位点特异性表达系统Flp/FRT,在Flp-In-CHO细胞中成功表达了hFⅦ,为其制备和纯化奠定了基础。     

破伤风毒素C片段基因克隆及重组表达研究

破伤风毒素片段C分子不具备神经毒毒性，在动物实验中可诱导小鼠产生中和抗体，并能保护小鼠抗破伤风毒素攻击，是理想的亚单位疫苗候选者。我们用基因工程技术在大肠杆菌中重组表达破伤风毒素片段C抗原，为研制新型破伤风疫苗打下基础。从破伤风梭状芽胞杆菌中提取其总DNA，取100ngDNA，利用PCR技术从中扩增出1.4Kb的破伤风毒素片段C基因。扩增产物经限制性内切酶BurnHI、Sail在37C酶切消化后，通过低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化，随后克隆进大肠杆菌谷航甘防流基转移酶融合表达载体PGEX－4T－2相应的限制性内切酶克隆位点，组建成重…     

脑心肌炎病毒VP2基因真核表达质粒的构建

目的构建脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)VP2基因真核表达质粒,并于CHO细胞中表达。方法 RT-PCR法扩增EMCV VP2目的基因,克隆至载体pcDNA3. 1中,构建重组质粒pcDNA3. 1-VP2,脂质体法转染CHO细胞。转染48 h后,RT-PCR法检测EMCV VP2基因mRNA的转录情况,免疫组化法及Western blot法检测EMCV VP2蛋白的表达情况。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pcDNA3. 1-VP2构建正确。EMCV VP2基因m RNA及蛋白可在CHO细胞中正常转录及表达,且EMCV VP2蛋白可与兔抗EMCV阳性血清发生特异性结合,主要分布于CHO细胞膜上。结论成功构建了重组质粒pcDNA3. 1-VP2,并有效地在CHO细胞中进行了表达,为EMCV VP2基因体外表达及其功能的进一步研究奠定了基础。     

人NIRF基因真核表达质粒的构建及其蛋白产物的生物信息学分析

目的克隆人NIRF基因,构建其真核表达质粒,并运用生物信息学方法对NIRF蛋白进行分析。方法应用RT-PCR技术,从HeLa细胞中扩增NIRF基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1-Flag中,双酶切鉴定并测序。在NCBI蛋白质结构数据库中寻找与NIRF具有较高同源性的1WY8和1Z6U,并利用Insight II结构生物信息学分析软件分析NIRF蛋白的结构和功能。结果扩增出约2400bp的人NIRF全长cDNA;重组真核表达质粒pcDNA3.1-Flag-NIRF酶切后,可见约2400bp的目的片段;测序结果表明NIRF全长cDNA与GenBank中NIRF序列完全一致。1WY8片段有3个赖氨酸残基,主要位于蛋白空间构象的表面;1Z6U片段含有Ring finger结构域,具有ligase活性。结论已成功克隆了人NIRF基因全长cDNA,构建了其真核表达质粒,并利用生物信息学方法,初步分析了NIRF蛋白泛素化作用的机理。     

产气荚膜梭菌β_2-β_1融合基因的构建及初步表达

目的构建产气荚膜梭菌β2-β1毒素融合基因并在重组大肠杆菌中表达。方法采用PCR方法,从含β2毒素基因质粒CPB2-9中扩增出β2毒素基因,经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后,回收0.73kb片段,再将含β1毒素基因质粒pXETB1经同样双酶切回收,与β2片段连接,转化BL21(DE3)中,进行诱导表达。结果经SDS-PAGE和Westernblot分析表明,重组菌株BL21(DE3)可表达β2-β1融合蛋白,且该蛋白可以被相应的抗体所识别。结论已成功构建了β2-β1融合基因,并在重组大肠杆菌中表达。     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒表达载体,并进行鉴定。方法将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆至慢病毒载体pLVX-ZsGreen-IRES上,筛选阳性重组克隆。将质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞系,通过荧光显微镜观察报告基因表达情况。收集上清,经浓缩后接种293T细胞,进行重组慢病毒感染细胞的鉴定;用限制性内切酶切除质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G绿色荧光蛋白基因,采用直接免疫荧光试验检测狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。结果重组慢病毒表达载体经酶切和测序证明构建正确。荧光显微镜下可见重组慢病毒感染的293T细胞有大量绿色荧光出现,病毒滴度为3×107 IU/ml;直接免疫荧光检测表明,糖蛋白基因在293T细胞内获得有效表达。结论成功构建了狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒载体,为狂犬病基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

抗乙型肝炎病毒表面抗原的IgG全抗体表达载体的构建

目的构建抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体杆状病毒表达载体。方法用PCR方法扩增抗HBsAg抗体Fab片段的轻链(L)及重链Fd段(VH+CH1)基因片段,将杆状病毒载体pAC-k-Fc与L基因连接,重组为过渡表达载体pAC-k-L-Fc,再与Fd基因连接,构建重组表达载体pAC-HBs-Fc,并进行酶切鉴定及DNA测序分析。确定正确后,转染昆虫细胞sf9,用免疫荧光检测IgG的表达。结果PCR扩增的片段约650bp,与预期值一致。载体pAC-k-L-Fc和pAC-HBs-Fc的酶切片段和DNA序列与预期结果一致。转染sf9细胞呈阳性荧光反应,未转染细胞呈阴性荧光反应。结论已成功构建表达载体pAC-HBs-Fc,为表达抗人HBsAg的IgG全抗体奠定了基础。     

瓣状内切核酸酶1基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建瓣状内切核酸酶1(Flap endonuclease 1,FEN1)基因重组真核表达质粒,并进行鉴定。方法提取L02细胞总RNA,逆转录合成cDNA,经巢式PCR扩增FEN1基因,定向克隆至载体pcDNA3.1,构建重组真核表达质粒,经酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的真核表达质粒转染293T细胞,Western blot检测FEN1蛋白的表达。结果 FEN1基因重组真核表达质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;在相对分子质量约47 000处可见目的蛋白条带,转染细胞中FEN1蛋白表达量较空载体转染组及空白细胞对照组提高约3倍。结论已成功构建了FEN1基因重组真核表达质粒,并可在293T细胞中过表达FEN1。     

汉坦病毒核蛋白基因截短片段在大肠杆菌中表达及其产物的初步应用

目的　获得汉坦病毒重组核蛋白 ,并将其应用于血清学诊断。方法　采用PCR方法 ,从带有HTN型Z10株病毒全长核蛋白基因的质粒上扩增读码框的前 35 4bp的核蛋白基因片段。将截短的核蛋白基因片段插入表达载体pGEX 2 0T ,得到重组质粒pGEX2 0 Z10trNP ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达 ,表达产物经Glu tathioneSepharose 4B柱纯化 ,并进行抗原性及抗原特异性检测。结果　pGEX2 0 Z10trBP表达产物是相对分子质量约为 4 0 0 0 0的谷光甘肽转移酶 (GST)融合蛋白GST Z10trNP。经Westernblot分析 ,GST Z10trNP具有良好的抗原性。用纯化GST Z10trNP为抗原 ,用ELISA间接法检测出血热病人血清、出血热疫苗免疫的家兔及小鼠血清 ,均能很好地区分阴性和阳性血清。结论　GST Z10trNP表达量高 ,易于纯化 ,并且具有良好的抗原性及抗原特异性 ,是一种安全、廉价的诊断抗原。     

猪流感复合多表位核酸疫苗的构建及其表达研究

目的构建猪流感病毒复合多表位核酸疫苗,并研究其表达产物的抗原性。方法以H3、H9亚型流感的HA抗原表位及流感病毒的其它主要抗原(NP、NA、M)表位基因为基础,再附以Kozak序列和适当的酶切位点,设计并合成一段长765bp的复合多表位基因(Epi),其中各表位基本独立,将其克隆入真核表达载体pIRES1neo,构建重组质粒pIRE-Epi。将多表位抗原基因Epi插入到融合表达基因H57中,构建重组质粒pIRE-H57-Epi。将构建的重组质粒在Hela细胞中表达,并用免疫荧光方法初步检测所表达蛋白的抗原性。结果所构建的融合表达载体pIRE-Epi和pIRE-H57-Epi,在Hela细胞中表达出流感病毒多表位抗原蛋白,并具有抗原性。结论已成功构建猪流感病毒多表位基因,有可能成为较理想的猪流感候选疫苗。     

微小隐孢子虫CP15/60基因在Hela细胞中的表达

目的 构建隐孢子虫CP15/60真核表达载体pcDNA3.1-15/60,观察其在Hela细胞中的表达。方法用Xho I和EcoR　I从pMD18-T-15/60中酶切得到CP 15/60基因,将其插入真核表达载体pCR3.1（+）的 XhoI和EcoRI位点,构建CP15/60真核表达载体pcDNA3.1-15/60,用脂质体介导法将其转染Hela细胞,并用G418加压筛选,用RT-PCR方法检测外源CP15/60基因的转录,ELISA法和间接免疫荧光法检测其活性。结果 酶切鉴定表明已成功构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-15/60,外源CP15/60基因能在转染细胞中有效转录,经检测表达产物具有良好的生物活性。结论 已成功地构建了pcDNA3.1-15/60真核表达载体,并在Hela细胞中具有良好的表达。     

DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗的设计与表达

目的利用塞姆利基森林病毒(SFV)复制子构建新型真核表达载体,并对含HIV-1中国流行株B亚型核心蛋白p24及多表位MEG嵌合基因的核酸疫苗进行表达与鉴定。方法将含SFV复制子的元件从pSFV-MCS中切下,连入含CMV启动子及增强子的pIRESneo载体中,构建新型真核表达载体pCS,再将含HIV-1 MEGp24基因插入至pCS载体中,构建重组核酸疫苗pCS-MEGp24。用脂质体法将重组质粒转染入BHK-21细胞,进行表达产物的检测。结果间接免疫荧光检测显示,重组质粒转染的BHK-21细胞能有效表达HIV-1 MEGp24,并与HIV阳性血清反应。结论所构建的核酸疫苗可在BHK-21细胞系内进行表达,且MEGp24基因的表达蛋白具有特异性,为构建新型HIV-1中国流行株核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。     

人黏蛋白1串联重复区基因真核表达载体的构建及其在动物细胞中的表达

目的构建人黏蛋白1串联重复区(MUC1 VNTR)17重复序列肿瘤抗原真核表达载体,并在COS-7、HeLa和Lewis细胞中表达。方法设计1对分别含SalⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,PCR法合成1重复MUC1 VNTR片段,克隆入pGEM-Teasy载体,依据SalⅠ和XhoⅠ酶切产生相同黏性末端的特性,依次连接,构建17重复MUC1 VNTR(17m),再亚克隆至VR1012真核表达载体,构建真核表达质粒VR1012-17m。分别转染COS-7、HeLa和Lewis细胞,并进行检测。结果酶切鉴定和序列分析证实,构建的重组质粒含17m序列,经转染的COS-7、HeLa和Lewis细胞,RT-PCR检测均有17m mRNA转录,Western blot检测均有17m蛋白的表达,并与MUC1 VNTR单抗产生特异性反应。结论已成功构建17m肿瘤抗原真核表达载体,并在COS-7、HeLa和Lewis细胞中得到表达,可用于MUC1疫苗和肿瘤生物学治疗的进一步研究。     

人IL-10 cDNA克隆、表达及其生物学活性

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10(Human Interleukin,hIL-10)。方法 用RT-PCR自白血病细胞株K562 RNA扩增hIL-10 cDNA片段(约500bp),克隆至质粒载体pSK(+),并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRI和 BamHI消化pSK/IL-10重组质粒,分离hIL-10片段,并插入原核表达载体pBV220的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pBV/IL-10。转化菌株经42℃诱导,用SDS-PAGE和Westem blot鉴定表达的重组蛋白。表达的重组蛋白经谷胱甘肽复性缓冲液复性,用RT-PCR检测其对外周血单核细胞(PBMC)合成IFN-γ的抑制作用。结果 RT-PCR扩增的DNA片段与hIL-10 cDNA大小一致。重组质粒pSK/IL-10的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hIL-10 cDNA序列一致。SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为18000,其表达量达菌体总蛋白的20％左右。Westem blot分析显示,重组蛋白能特异性地与抗hIL-10抗体结合,复性的重组蛋白能明显抑制PBMC合成IFN-γ。结论 已成功地构建了表达具有生物学活性的重组hIL-10(Recombinant hIL-10,rhIL-10)的工程菌株。     

百日咳毒素S1亚单位截短片段的表达、纯化及初步应用

目的表达并纯化百日咳毒素(PT)S1亚单位截短片段S146,以其制备抗体,初步建立检测PT的双抗体夹心ELISA法。方法PCR扩增S146基因,亚克隆至载体pUC18,鉴定正确后,插入表达载体pET16b,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用镍离子亲和层析柱纯化,复性后的蛋白免疫家兔,制备抗血清,纯化后作为包被抗体,建立检测PT的双抗体夹心ELISA法,并检测其特异性。结果表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要存在于破菌沉淀中,表达量占菌体总蛋白的44%;纯化后蛋白纯度为94.5%;家兔抗血清可特异性识别天然PTSI;建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好。结论已成功表达、纯化了PTS1亚单位截短片段S146,并以纯化的抗S146抗体作为包被抗体,初步建立了检测PT的双抗体夹心ELISA法,为研制特异性检测试剂和提供一种疫苗的质量控制方法奠定了基础。     

HCV核心区全基因片段的表达及产物抗原活性分析

目的 表达并纯化核心基因全片段,以得到良好特异性的核心蛋白。方法 自克隆载体pUC19/HCV-C中切下核心基因全片段,将其插入带有His 6纯化标签的融合表达质粒pTrcHisA中,转化入大肠杆菌,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE、中和抑制ELISA和Western blot对占菌体总蛋白15％以上的表达产物进行鉴定,用IMAC一步法纯化,纯化产物检测HCV阴阳性血清标本,并与日本东燃公司核心抗原C_(11)检测结果进行比较。结果 核心基因全片段插入pTrcHisA载体,转化入大肠杆菌TOP10后构建成功稳定的表达株PTrcHisA/HCV-C/TDP10,用纯化产物检测血清标本,与日本东燃公司核心抗原C_(11)检测结果的阳性均值与阴性均值之比及A值分布基本相同。结论 表达抗原具有良好的免疫反应性和特异性。