激活素A及激活素结合蛋白在急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中的表达

目的探讨激活素A(Activin A)及激活素结合蛋白(Follistatin,FS)在急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中的表达。方法通过1次/12 h给予小鼠5 g/Kg酒精连续灌胃3次,复制急性酒精性肝损伤小鼠模型,采用实时定量RT-PCR检测小鼠肝组织Activin A及FS mRNA表达水平,免疫组织化学染色观察小鼠肝组织Activin A及FS蛋白的表达水平。结果急性酒精性肝损伤小鼠肝组织Activin A mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.01);FS mRNA和蛋白表达水平与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论急性酒精性肝损伤小鼠肝组织Activin A-FS表达失衡,以Activin A升高为主,提示Activin A-FS系统失衡可能与酒精性肝损伤有关。     

小鼠激活素受体相互作用蛋白5的基因克隆

目的克隆新的小鼠激活素受体相互作用蛋白5(ActRIP5)基因。方法应用酵母双杂交技术,筛选出与激活素ⅡA型受体(ActRⅡA)相互作用蛋白的基因片段,再以此基因片段作为探针,从小鼠脑cDNA文库中钓取ActRIP5cDNA。采用哺乳动物细胞双杂交系统,进一步确定ActRIP5与ActRⅡA的相互作用。采用RT-PCR检测ActRIP5mRNA在组织中的转录。结果克隆的ActRIP5全编码基因长1839bp,编码145个氨基酸残基,与ActRⅡA具有特异结合作用。ActRIP5mR-NA在小鼠多种组织中均可检出。结论ActRIP5属于ActRIP家族新成员,可以与ActRⅡA相互作用。     

激活素受体相互作用蛋白在海马神经细胞中的表达及其作用

目的　在发现和克隆新的激活素受体相互作用蛋白 3(ActRIP3)基因的基础上 ,探讨ActRIP3在海马神经细胞介导激活素信号传导的作用。方法　利用GST- ActRIP3融合蛋白免疫家兔制备抗ActRIP3抗体 ,采用RT -PCR及免疫组化染色分析ActRIP3在脑组织中的表达与分布 ,采用pcDNA-ActRIP3与CAGA -lux质粒共转染海马神经细胞 ,分析信号传导作用。结果RT- PCR及免疫组化染色显示ActRIP3在海马神经细胞中高表达 ,构建的pcDNA- ActRIP3表达载体在体外培养海马神经细胞中可有效表达ActRIP3蛋白 ,过表达ActRIP3可促进激活素诱导的海马神经细胞特异信号传导。结论　ActRIP3具有促进激活素信号传导作用 ,是介导激活素作用于海马神经细胞的关键性信号传导蛋白。     

激活素受体相互作用蛋白1,2在小鼠脑神经细胞中的共表达

目的探讨激活素受体相互作用蛋白1(activin receptor-interaction protein 1,ARIP1)和ARIP2在小鼠脑神经细胞中的共表达。方法 RT-PCR法检测C57BL小鼠小脑、垂体、大脑、脾脏、心脏、肾脏、肝脏、胰腺组织中ARIP1和ARIP2基因mRNA的转录;以融合蛋白GST-ARIP1C和MBP-ARIP2C作为抗原免疫新西兰白兔,制备抗ARIP1和ARIP2抗体,经A蛋白亲和层析柱纯化后,ELISA法检测抗体的交叉反应;用制备的抗体,采用免疫组织化学染色检测ARIP1和ARIP2在小鼠脑组织中的表达;RT-PCR法检测小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞中激活素ⅡA型受体(activin receptorⅡA,ActRⅡA)、ARIP1和ARIP2基因mRNA的转录。结果在小鼠大脑、小脑及垂体组织中可见ARIP1基因mRNA的转录,在小鼠各部位组织中均可见ARIP2基因mRNA的转录;制备的兔抗ARIP1和ARIP2抗体无交叉反应;ARIP1和ARIP2在小鼠脑组织的海马和下丘脑同时表达;ActRIⅡA及ARIP1和ARIP2 mRNA在神经元样细胞系Neuro-2a细胞中共表达。结论 ARIP1和ARIP2可在小鼠脑神经细胞中共表达。     

激活素受体相互作用蛋白2在小鼠Hepa1-6细胞中的表达及调控

目的研究激活素受体相互作用蛋白2(ARIP2)在小鼠肝细胞中的表达及调控。方法采用半定量PCR技术检测ARIP2 mRNA在Hepal-6细胞中转录水平的动力学变化规律及其调控因素。结果Activin A刺激Hepal-6细胞ARIP2 mRNA的转录水平呈时间依赖性升高,刺激早期(4h)无明显变化,12h后显著升高。信号传导激动剂PMA和LPS刺激He- pal-6细胞24h,均可上调ARIP2 mRNA的转录水平,而A23187则抑制其转录。ARIP2过表达明显抑制Hepal-6细胞ActRIIA mRNA的转录水平,对ActRIIB则无影响。结论ARIP2作为激活素信号传导抑制蛋白,其表达受多种因素影响。ARIP2可能通过影响ActRIIA表达,参与激活素作用后期的信号传导负反馈调节过程。     

激活素A对小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的影响

目的探讨激活素A对小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的影响。方法分离小鼠腹腔巨噬细胞,将其分为激活素A处理组和对照组,瑞氏-吉姆萨染色观察小鼠腹腔巨噬细胞形态学变化;流式细胞术分析小鼠腹腔巨噬细胞表面分子CD68的表达;ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-10及TNFα的水平;Griess法检测小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO的水平。结果经激活素A刺激后,显微镜下可见呈不规则、多边型的活化巨噬细胞增多,细胞表达巨噬细胞成熟标志CD68增加,Ⅱ型巨噬细胞(M2)产生的细胞因子IL-10及NO分泌水平升高,而Ⅰ型巨噬细胞(M1)产生的细胞因子TNFα水平无变化。结论激活素A可能主要促进小鼠Ⅱ型巨噬细胞分泌细胞因子。     

激活素A抑制脂多糖活化巨噬细胞的作用机制

目的探讨激活素A(Activin A)抑制脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)活化巨噬细胞的作用机制。方法取小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,分别添加Activin A(5 ng/ml)、LPS(1μg/ml)和Activin A(5 ng/ml)+LPS(1μg/ml),同时设以含单纯2.5%胎牛血清的DMEM培养液培养的细胞作为对照孔,培养24 h后,采用还原酶法检测细胞分泌一氧化氮(Nitric oxide,NO)的水平,流式细胞术分析TLR2和TLR4蛋白的表达水平,RT-PCR分析细胞ActRⅡA和ActRⅡB基因mRNA的转录水平。结果 Activin A和LPS单独作用均促进RAW264.7细胞分泌NO,但二者联合使用时,Activin A可抑制LPS刺激RAW264.7细胞的NO分泌;Activin A能抑制LPS上调RAW264.7细胞TLR4蛋白的表达,但对TLR2蛋白的表达无影响;LPS可促进RAW264.7细胞ActRⅡA基因mRNA的转录水平,但对ActRⅡB基因mRNA的转录水平无影响。结论 Activin A通过调控TLR4途径抑制LPS的作用,LPS可能通过促进ActRⅡA的表达进一步增强Activin A的负反馈调节作用。     

激活素A对体外培养小鼠胎鼠大脑皮层神经元存活的促进作用

目的研究激活素A(Activin A)对体外培养小鼠胎鼠大脑皮层神经元存活的促进作用。方法原代培养孕期17d小鼠胎鼠脑神经细胞,免疫细胞化学染色观察激活素受体(ActRIIA)在神经细胞中的表达;将原代培养神经细胞分为阴性对照组(5%胎牛血清-DMEM/F12培养基)、阳性对照组(4ng/ml神经生长因子)和激活素A(5ng/ml)组,分别于培养第1、3、5、7和9天,采用台酚蓝染色法检测神经元存活情况。结果培养的小鼠胎鼠脑神经细胞可表达ActRIIA;阴性对照组存活神经元呈时间依赖性减少,在培养第9天已检测不到存活的神经元;而阳性对照组和激活素A组在培养第9天仍有部分神经元存活。结论激活素A具有维持小鼠胎鼠大脑皮层神经元长期存活的作用。     

激活素A对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬活性的促进作用

目的探讨激活素A对巨噬细胞吞噬活性的促进作用及其机制。方法分别通过中性红试验、鸡红细胞法和流式细胞术,检测激活素A对巨噬细胞系RAW264.7细胞的吞饮活性、吞噬活性以及对MHCⅠ、Ⅱ类分子和CD68表达的影响。结果激活素A可明显促进RAW264.7细胞的吞饮及吞噬活性,对MHCI、II类分子表达没有影响,但可明显上调巨噬细胞表面分子CD68的表达。结论激活素A可促进巨噬细胞系RAW264.7细胞吞噬活性,这与其促进巨噬细胞成熟有关。     

ActRⅡA在小鼠巨噬细胞的表达

目的：克隆、表达重组融合蛋白ActRⅡA的C末端肽，制备抗ActRⅡA C末端抗体，并检测其在小鼠巨噬细胞中的表达。方法：构建GST－ActRⅡAC末端蛋白表达质粒，经SDS－PAGE分析表达蛋白，以GST－ActRⅡA C末端蛋白为抗原免疫家兔制备抗ActRⅡAC抗体，采用免疫细胞化学染色技术观察ActRⅡA在巨噬细胞的分布。结果：克隆得到的ActRⅡAC末端cDNA，经DNA测序证实所克隆的cDNA与GenBank收录的ActRⅡAC末端基因序列完全相符。SDS－PAGE分析表达的GST－ActRⅡA C蛋白相对分子质量约为37000。采用亲和层析纯化的抗ActRⅡAC末端抗体进行免疫细胞化学染色显示，ActRⅡA在小鼠巨噬细胞中高水平表达。结论：已成功地构建了ActRⅡAC末端表达质粒，制备了抗ActRⅡAC末端抗体并证实小鼠巨噬细胞表达存在ActRⅡA。     

激活素A对巨噬细胞系RAW264.7细胞吞饮活性及TLR4表达的双向调节作用

目的探讨激活素A(ActivinA)对巨噬细胞系RAW264.7细胞活性的调节作用及其可能的机制。方法取对数生长期的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,加入1μg/ml脂多糖(LPS),继续培养8h,采用ELISA法检测细胞分泌ActivinA水平;分别加入ActivinA、LPS和ActivinA+LPS,中性红染料法检测细胞吞饮活性;流式细胞术分析细胞表面分子MHCⅠ、MHCⅡ及Toll样受体4(TLR4)的表达水平。结果LPS呈时间依赖性刺激RAW264.7细胞分泌ActivinA;ActivinA可明显促进静息RAW264.7细胞的吞饮活性,而对MHCⅠ、MHCⅡ及TLR4的表达水平无明显影响;ActivinA和LPS共同作用,ActivinA明显抑制了LPS活化的RAW264.7细胞的吞饮活性,并下调TLR4的表达。结论ActivinA可能以自分泌/旁分泌形式参与巨噬细胞活性调节,其抑制LPS作用与TLR4表达有关。     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压的相关性

目的研究血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因A1675G多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压(EH)的相关性。方法随机选取山东省济宁地区汉族女性EH患者127例(EH组)和体检正常的女性119例(正常对照组),提取外周血基因组DNA,PCR扩增A1675G基因,高分辨率熔解(HRM)法测定A1675G基因的多态性。结果EH组AA、AG和GG基因型频率(分别为26.8%、53.5%和19.7%)与正常对照组(分别为27.7%、42.0%和30.3%)比较,差异均无统计学意义;等位基因频率(A:53.5%;G:46.5%)与正常对照组(A:48.7%;G:51.3%)比较,差异也无统计学意义。结论A1675G基因多态性可能与山东省济宁地区汉族女性原发性高血压无明显相关性。     

人源大麻素Ⅰ型受体基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建人源大麻素Ⅰ型受体(human cannabinoid receptor 1,hCBⅠ)基因GV230真核表达质粒,并于HEK-293细胞中进行表达。方法以人脑皮质细胞的总RNA为模板,扩增获得hCBⅠ基因,克隆至真核表达载体GV230,构建重组表达质粒GV230-hCBⅠ,筛选阳性克隆,脂质体瞬时转染HEK293细胞。置倒置荧光显微镜下观察,并采用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)和Western blot法检测hCBⅠ基因在HEK293细胞中的表达。结果重组表达质粒GV230-hCBⅠ经双酶切及测序鉴定,构建正确。转染48 h后,转染率约40%,CBⅠ蛋白主要于细胞膜分布及表达,且于相对分子质量约50 000处可见特异性条带。结论成功构建了重组真核表达质粒GV230-hCBⅠ,并于HEK293细胞中表达,为进一步研究CBⅠ的生物学功能奠定了基础。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白受体结合活性检测方法的改进

目的对重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)-抗体融合蛋白的受体结合活性检测方法进行改进。方法采用夹心ELISA法对系列稀释的重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白供试品和参比品进行检测,通过四参数方程拟合,计算二者的半数有效浓度(EC50),分析其受体结合活性。对改进的方法进行精密性和准确性验证,并与原方法进行比较。结果重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白供试品和参比品均存在量效关系,符合四参数方程y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D;3批重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白经3次测定,受体结合活性分别为(133±8)、(114±4)和(138±9)BU,符合其质量标准中受体结合活性65～135 BU的规定,变异系数分别为6.02%、3.51%和6.52%;1批供试品经3次重复测定,回收率为(107.67±7.50)%;3批供试品采用原方法和改进方法分别重复测定3次,受体结合活性差异均无统计学意义(P>0.05)。结论改进的方法精密性好,准确性高,可作为重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白受体结合活性的常规检测方法。     

槲皮素对对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用

目的：探究槲皮素(Quercetin,Que)对对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制。方法：将24只雄性C57BL/6J小鼠随机分成3组,每组8只,分别为正常对照组(CON组)、APAP模型组(APAP组,腹腔内注射350 mg/kg APAP溶液))、槲皮素给药组(APAP+Que组,造模2 h后灌胃100 mg/kg槲皮素溶液),APAP处理24 h后进行取材。HE染色法观察各组小鼠肝脏组织病理学变化;用试剂盒测定各组小鼠血清ALT和AST的水平和肝组织GSH的含量;Western blot法测定p-JNK和JNK的表达水平。结果：与CON组相比,APAP组病理学显示大量的炎性细胞浸润,经槲皮素干预后显示肝损伤明显减轻;与APAP组相比,APAP+Que组血清ALT、AST水平均降低(P<0.001),APAP+Que组肝脏组织GSH含量升高(P<0.001);与APAP组相比,Western blot实验结果显示,APAP+Que组小鼠肝脏组织中p-JNK/JNK的比值明显下降。结论：Que对APAP诱导的急性肝损...     

激活素A对L929细胞活性的调节作用

目的探讨激活素A对小鼠纤维母细胞L929活性的调节作用。方法用不同剂量的激活素A刺激L929细胞,应用还原酶法分析细胞分泌一氧化氮(NO)的水平,RT-PCR法检测细胞诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、纤维连接蛋白(FN)和金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)mRNA的表达,应用中性红检测细胞的吞饮活性,MTT法检测细胞的增殖活性。结果L929细胞经激活素A刺激后,与对照组细胞比较,分泌NO的水平明显升高,iNOS mRNA及FN mRNA的表达水平也升高,而TIMP mRNA的表达水平无明显改变。激活素A可以促进L929细胞的吞饮活性,但对L929细胞的增殖活性无影响。结论激活素A具有促进L929细胞分泌炎性介质和形成细胞外基质的作用,这可能是其促进炎症发展、诱导组织纤维化的原因。     

蛋白酶激活受体-2在胃间质瘤组织中的表达及其临床意义

目的探讨蛋白酶激活受体-2(Protease activated receptor-2,PAR-2)在胃间质瘤组织中的表达及其与胃间质瘤临床病理特征之间的相关性。方法采用RT-PCR、Western blot及免疫组化法检测PAR-2在72例胃间质瘤患者的瘤中心组织、瘤旁组织及正常胃组织中的表达,并分析其与胃间质瘤临床病理特征之间的相关性。结果瘤旁组织和瘤中心组织中PAR-2基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显高于正常组织(P<0.05或P<0.01),瘤中心组织中的表达水平明显高于瘤旁组织(P<0.01)。瘤中心组织中PAR-2基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均随着NIH分级的升高而上调(P<0.05或P<0.01),且与黏膜受侵情况密切相关(P<0.05)。结论胃间质瘤组织中PAR-2的表达水平明显高于瘤旁组织和正常胃组织,PAR-2的高表达可能与间质瘤的侵袭与转移相关。     

高脂喂养SD大鼠体内花生四烯酸乙醇胺水平及Ⅰ型大麻素受体表达的变化

目的探讨高脂饮食诱导肥胖SD大鼠脂肪代谢紊乱对内源性大麻素系统(endocannabinoid system,ECS)的影响及其机制。方法建立高脂饮食诱导肥胖SD大鼠模型,每周称量大鼠体重;采用酶比色法测定大鼠血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平;高效液相色谱法检测大鼠血浆中大麻内源性配体花生四烯酸乙醇胺(anandamide,AEA)的含量;Western blot法检测大鼠附睾脂肪组织中Ⅰ型大麻素受体(cannabinoid receptorⅠ,CB1)的表达。结果大鼠经高脂饮食持续喂养8周,体重均不同程度增加;血清中TC、TG、LDL-C和血浆中AEA水平均显著升高(P0.05);附睾脂肪组织中CB1的表达量也显著增加(P0.05)。结论通过高脂饲料成功诱导SD大鼠的TC、TG和LDL-C升高,使大鼠产生高脂血症;大鼠血清AEA水平和血浆中CB1表达的显著变化表明肥胖大鼠体内ECS在肥胖过程中发生了显著改变,本研究在一定程度上建立了ECS与肥胖之间的联系。     

烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）及其在杀虫剂创制中的作用

评述了杀虫剂重要靶标部位烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的研究进展,同时讨论了昆虫nAChR在杀虫剂创制中的作用。