纳秒级脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的窗口效应

ns级脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡用于肿瘤病变的治疗,展现出令人振奋的临床应用前景。由于ns级脉冲电场诱导的凋亡率高低与场强-脉宽等参数存在一定的选择性,使得目前脉冲参数的选择存在较大的盲目性。为寻求诱导肿瘤细胞有效凋亡的ns级脉冲电场参数,将不同参数组合(电压幅值9 kV,脉宽分别为1、50、100与200 ns,脉冲个数分别为10、30、60与80,频率1 Hz)的ns级脉冲电场作用于SKOV3细胞。利用AnnexinV/PI双染法检测细胞早期凋亡率和坏死率,DNA ladder凝胶电泳实验检测细胞晚期凋亡情况,AnnexinV/PI双染法以及DNA ladder凝胶电泳实验表明:细胞的早期凋亡率同施加的脉冲电场参数存在窗口效应,且脉冲参数为100 ns、30个脉冲时可得到最大的凋亡率与坏死率差值。     

纳秒脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的内质网信号通路分析

ns脉冲电场在诱导肿瘤细胞凋亡方面展现出诱人的应用前景。由于ns脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚未明确,严重阻碍了ns脉冲电场肿瘤治疗的临床进程。为进一步揭示其诱导凋亡的机制,将参数组合(电压幅值9kV,脉宽100ns,脉冲30个,频率1Hz)作用于人卵巢浆液性囊腺癌(SKOV3)细胞。首先检测了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteine aspartic acid specific protease-12,Caspase-12)蛋白的释放水平,其次用浓度分别为0、25、50、100μmol/L的钙螯合剂(BAPTA-AM)螯合细胞内的游离Ca2+,用Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡率,最后采用蛋白质印迹(western blot)技术检测了Caspase-12蛋白释放的变化。试验结果表明:ns脉冲诱导SK-OV3凋亡时引起了细胞内Ca2+升高,从而介导内质网凋亡信号通路。该研究结果将进一步揭示ns脉冲诱导凋亡的机制。     

细胞骨架在ns脉冲诱导肿瘤细胞凋亡中的作用

为了研究细胞骨架在ns脉冲诱导肿瘤细胞凋亡中的作用,将脉冲电场参数组合(电场强度10kV/cm,脉宽500ns,脉冲30个,频率1Hz)作用于细胞骨架裂解的Hep-G2细胞。利用Annexin-V和碘化丙碇(propidium i-odide,PI)双染法检测细胞凋亡和坏死情况;采用荧光分光光度计观测线粒体跨膜电位和细胞膜穿孔的变化情况。试验发现:肌动蛋白裂解后脉冲处理组的细胞凋亡和坏死大大降低(与单独脉冲处理组相比检验水平P<0.05),早期细胞凋亡由(16.94±2.87)%下降到(4.77±1.87)%;晚期凋亡和坏死由(20.94±3.09)%下降到(14.38±2.60)%;脉冲处理组和肌动蛋白裂解后脉冲处理组的细胞线粒体跨膜电位都出现下降,但后者的线粒体跨膜电位却明显高于前者(P<0.05);单独脉冲处理组和细胞骨架缺失后脉冲处理组二者在相同时间点时其PI荧光强度无明显差异,且PI荧光随时间而变化的规律亦相似。上述结果表明:细胞骨架的缺失抑制了ns脉冲诱导细胞凋亡的线粒体通路,进而降低细胞凋亡水平,但对细胞膜的穿孔情况无明显影响。     

高频双极性脉冲诱导SKOV–3细胞生物电效应的实验研究

不可逆电穿孔技术以其非热、微创的独特优势而广泛应用于肿瘤治疗领域,但在治疗过程中会出现消融不彻底与肌肉收缩这2个问题;高频双极性脉冲作为新式脉冲形式可在肿瘤组织中产生均匀电场来解决肌肉收缩难题,同时与传统脉冲相比能有效缓解肌肉收缩。为此,以SKOV–3细胞为研究对象,采用CCK–8检测细胞活性,采用JC–1荧光探针分子观察线粒体膜电位变化,采用免疫组化技术检测凋亡蛋白表达。研究发现：传统单极性脉冲对肿瘤细胞的杀伤机理主要是对细胞膜的不可逆破坏,继而导致细胞坏死;ns高频双极性脉冲虽然与传统脉冲具有相同的电场强度与高电平时间,但却不能有效杀死肿瘤细胞;而μs高频双极性脉冲不仅能有效诱导细胞坏死,而且通过活性检测发现也可能诱导细胞凋亡;进一步研究发现,μs高频双极性脉冲能作用于线粒体使线粒体膜电位崩溃;同时也检测出BAX、BCL–2、Caspase–3和Caspase–9凋亡蛋白的表达。该研究结果表明μs高频双极性脉冲不仅可诱导细胞坏死,而且可启动线粒体凋亡程序来杀死细胞。     

陡脉冲电场对肝癌细胞线粒体跨膜电位的影响

为研究陡脉冲电场的凋亡效应,以人肝癌细胞为实验对象,采用激光共聚焦扫描显微镜观察陡脉冲电场作用下细胞内线粒体跨膜电位的实时变化。实验结果表明,陡脉冲电场能使线粒体跨膜电位下降,较高的电压峰值、较窄的脉冲宽度(600 V/100 ns)比较低的电压峰值、较宽的脉冲宽度(200V/1.6μs)能使线粒体跨膜电位更快地下降,并且在停止施加陡脉冲电场后线粒体跨膜电位仍然在不断下降,进而有可能使线粒体跨膜电位崩溃,从而诱导肝癌细胞凋亡,为陡脉冲杀伤肿瘤细胞提供了理论依据。     

ns脉冲电场诱导裸小鼠皮下人黑色素移植瘤凋亡

为研究ns脉冲电场对在体肿瘤的诱导凋亡效应,以接种人黑色素瘤细胞A375的BALB/c裸小鼠为对象,采用电场强度20kV/cm、脉冲宽度300ns的脉冲电场处理后,抑瘤效应宏观观察到肿瘤组织的生长受到显著抑制(P<0.01),透射电子显微镜观察到典型的凋亡细胞超微结构形态,免疫荧光染色法定性检测到caspase-3蛋白表达明显增强,用RT-PCR方法定量检测到caspase-3 mRNA表达明显增强(P<0.01)。实验结果证实了ns脉冲电场能有效抑制在体肿瘤组织生长,机制在于其通过活化肿瘤细胞caspase-3蛋白酶而诱导肿瘤细胞调亡,为ns脉冲电场治疗肿瘤提供了依据。     

ns脉冲电场发生器的研制及应用

为了研究ns脉冲电场诱导肿瘤细胞的凋亡效应,结合开关电源技术和脉冲功率技术,研制了一套多参数大范围独立可调的ns脉冲电场发生器。该发生器由高压直流电源、脉冲形成电路和辅助电路3部分组成,输出的脉冲幅值0～1.2kV内连续可调,重复频率1Hz～10kHz内连续可调,脉冲宽度分100、200、600和1000ns4级可调,脉冲个数可以任意预置,上升时间<30ns,并具有显示和保护功能。实验室调试和医学细胞实验结果表明,该发生器调节方便、性能稳定,能够有效诱导人肝癌细胞凋亡,为ns脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的机理和阈值参数选择规律的深入研究奠定了基础。     

不同磁感应强度的微秒脉冲磁场对卵巢癌细胞SKOV3的影响

雷电μs脉冲电磁场的危害越来越严重,却鲜有人研究此μs脉冲电磁场对人的影响。为研究μs脉冲磁场的生物电磁效应机制以及对人体健康的影响,使用人卵巢癌细胞株SKOV3作为实验对象,采用实验室自制的μs脉冲磁场发生器产生不同磁感应强度的μs脉冲磁场(磁感应强度为1~200 m T,上升时间为800 ns,脉冲宽度为8.4μs,频率为8 Hz)处理细胞3 d时间,每天间隔12 h时间处理1次,每次处理时间为1 h。处理结束后24 h时间分别使用噻唑蓝(MTT)和流式细胞术(flow cytometry method,FCM)来检测细胞的增殖抑制率和凋亡率。结果显示:增殖抑制率与脉冲磁场的磁感应强度不呈现趋势变化关系,且增殖抑制率均低于5%,μs脉冲磁场对SKOV3细胞的增殖抑制率不具有统计学意义(概率P0.05);肿瘤细胞的凋亡率与脉冲磁场的磁感应强度也不呈现趋势变化关系,且凋亡率均低于12%,脉冲磁场对SKOV3细胞的凋亡也不具有统计学意义(概率P0.05)。研究结果揭示:不同磁感应强度(1~200 m T)的μs脉冲磁场对卵巢癌细胞SKOV3无显著影响。     

陡脉冲不可逆性电击穿恶性肿瘤细胞的研究

采用作者研制的陡脉冲治疗装置,以人卵巢腺癌SKOV3细胞为实验研究对象,通过倒置相差显微镜实时观察细胞形态在陡脉冲电场作用下的动态变化过程,用扫描电镜观察细胞膜表面的变化情况,并用透射电镜观察细胞超微结构的改变。研究发现,陡脉冲作用后的细胞发生明显肿胀,细胞核固缩;扫描电镜观察结果显示出细胞膜出现孔洞并发生破裂,细胞质外喷;透射电镜观察结果发现核肿胀,核膜不完整,胞质内细胞器结构模糊,微绒毛肿胀,胞浆、线粒体肿胀、空泡化,细胞膜多处断裂。这表明陡脉冲能使恶性肿瘤细胞发生不可逆性电击穿并导致其死亡。     

陡脉冲电场作用下细胞电场力的仿真计算(英文)

The basic characteristic of electric field is that the substance in the field is in operation by the stress. Under external electric fields,there is strong distribution of electric fields on the inside and outside surfaces of cell membrane. In virtue of the difference of the permittivity among membrane,cytoplasm and extracellular medium,there must be electric field stress on the surface of the membrane. The goal of the study is to research the irreversible electrical breakdown (IRE) mechanism of the malignant tumor cells under steep pulsed electric field (SPEF) from the views of mechanics. Electric field stress of plasma membrane under steep pulsed electric field is calculated and simulated both on malignant tumor cells and on the normal cells. The calculation results show that,in addition to a compressive stress normal to the membrane plane,transverse traction stresses are generated in the lateral plane of the membrane. The lateral stress will reduce the membrane tension significantly,leading to electroporation and rupture. At the same electric field strength,the transverse traction stress on malignant cell membrane is greatly larger than the one on normal cell membrane. Therefore,compared with the normal cells,the malignant tumor cells are more sensitive under the steep pulsed electric field. Namely,steep pulsed electric field can selectively destroy the malignant tumor cells,which proved the safety of treating malignant tumors by steep pulsed electric field.     

纳秒脉冲细胞内电处理机理及其研究进展

介绍了细胞内电处理效应的研究现状及其进展 ;重点描述了KarlHSchoenbach提出的脉冲电场与细胞相耦合的球形模型 ;探讨了细胞内电处理机理 ,即当脉冲作用于悬浮生物细胞时 ,随脉冲宽度变小 ,电场对细胞核及核膜影响增强 ,当脉宽大于细胞膜充电时间常数时 ,脉冲电场主要作用在细胞外膜上产生电穿孔 ;当脉宽小于细胞膜充电时间常数时 ,脉冲电场对细胞内进行电处理。     

陡脉冲致兔肝组织不可逆性电击穿的量效关系

为优化陡脉冲电场在肿瘤治疗的治疗参数,确定最佳的治疗剂量,实验研究了不同电压峰值、脉宽、频率组合的陡脉冲电场致正常兔肝组织细胞不可逆性电击穿范围(即杀伤面积)的量效关系。结果发现:不同参数组合的陡脉冲对杀伤面积有较大的影响,随着脉冲剂量增大,杀伤面积随之增加,但峰值电压约900V时趋于饱和,脉宽>5μs后杀伤面积增大较前明显。     

细胞内电处理用ns脉冲发生器研究进展

为了便于全面了解目前细胞内电处理实验研究的方法和具体实施方案,综述了国内外用于细胞内电处理实验研究的ns脉冲发生器。从电容器充放电和传输线理论2方面介绍了这些发生器产生ns级、高强脉冲电场的工作原理;分析了用于细胞内电处理的ns脉冲发生器性能特点、发生器的电路结构、元器件选择和技术指标等。实验结果表明,这些发生器产生的ns脉冲电场能诱导细胞内电处理效应。对今后的研究工作进行了讨论和展望。     

Effects of submicrosecond, high intensity pulsed electric fields on living cells - intracellular electromanipulation

Development of technology to produce nanosecond duration pulsed electric fields has allowed examination of the effects of ultrashort duration, high intensity electric fields on living cells. Theoretically, high intensity (MV/m) electric field applications with durations of less than one microsecond, when shortened toward nanoseconds, should increasingly affect intracellular rather than surface membranes of living cells. Experimentally, square-wave, 60 ns duration, high energy (36-53 kV/cm) pulses applied in trains of 1-10 pulses result in progressive increases in the numbers of permeabilized intracellular granules in a human eosinophil cell model-without large surface membrane effects. Electron micrographic examination of cells treated in this way demonstrates alteration of intracellular granule morphology consistent with permeabilization of granule membrane, i.e., intracellular electromanipulation. Continuous microscopic examination of individual living cells exposed to long or short duration pulsed electric field applications shows that permeabilization of surface membrane (median 5 minutes) with anodic preference (electroporation) and prompt cellular swelling follow a single, long duration (100 microsecond) pulse. In contrast, after a single short duration (60 ns) pulse, onset of surface membrane permeability is delayed (median 17 minutes), the increased permeability shows no anodic preference, and cellular swelling is absent suggesting that these effects are due to intracellular electromanipulation rather than direct effects on the surface membrane. Submicrosecond, intense pulsed electric fields applied to living cells achieve preferential effects on intracellular rather than surface membranes, potentially providing new approaches for selective/generalized cell or tissue ablation, growth stimulation and tissue remodeling.     

ns脉冲诱导细胞内电处理机理的研究进展

脉宽为ns级、场强≥10 kV/cm的脉冲电场能够对细胞内部结构产生影响而不会导致细胞外膜穿孔,即细胞内电处理效应。尽管细胞内电处理效应的机理目前还不是很清楚,但国内外学者一致认为细胞内电处理的根本原因是ns脉冲电场在细胞内膜上诱导出的跨膜电位超过了穿孔临界值,从而导致内膜穿孔。基于以上研究详细介绍了目前关于细胞内外膜跨膜电位的计算模型、方法及仿真计算结果,探讨了细胞内电处理的机理。宽脉冲电场难以透过外膜进入细胞内部,主要作用在外膜上,导致外膜发生电穿孔。随着脉冲宽度变小,电场对内膜作用增强。当脉宽减小到ns级时,脉冲电场感应出的内膜跨膜电位比外膜大,电场主要作用于膜内细胞器,诱导内膜穿孔,细胞结构和功能改变,即进行细胞内电处理。     

Apoptosis induction effects of steep pulsed electric fields (SPEF) on human liver cancer cell SMMC-7721 in vitro

To research the apoptosis effects of steep pulsed electric fields (SPEF) on human liver cancer cell SMMC-7721 in vitro, this paper studied Phosphatidylserine (PS) externalization detection utilizing flow cytometry, real-time change of mitochondrial transmembrane potential (Δ Ψ_m) using confocal laser scanning microscope (CLSM) and DNA fragmentation assay by agarose gel electrophoresis. The experiment results by flow cytometry showed that ?sSPEF (SPEF with electric field intensity of 200V/cm and duration of 1.3μs) effectively (P<0.05) induced PS externalization but nsSPEF (SPEF with electric field intensity of 600V/cm and duration of 100ns) did not (P>0.05). On the contrary, nsSPEF induced Δ Ψ_m decrease and DNA fragmentation more notably than μsSPEF. These results indicate that SPEF can distinctly induce apoptosis and the effects are electric field intensity/pulse duration-dependent. Theoretically calculation showed that temperature increase of cell solutions for treated groups exposed to SPEF was less than 1.3K without regard to heat dissipation. Multi-shelled dielectric cell model and frequency spectrum analysis showed that μsSPEF contained abundant low frequency components which mainly acted on plasma membrane, whereas nsSPEF contained plentiful high frequency components which permeated plasma membrane and mainly affected on intracellular organelle.