三重real-time PCR检测副溶血弧菌主要毒力基因

针对编码副溶血弧菌的特异性基因和主要毒力基因tlh、tdh、ureR进行引物及探针设计,通过优化反应条件,建立基于Taqman探针快速检测副溶血弧菌毒力基因的三重实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）方法。利用10 株副溶血弧菌和22 株非副溶血弧菌对设计的引物及探针进行特异性验证,结果表明设计的引物及探针具有很高的特异性;优化后的引物浓度分别为tdh 0.15 μmol/L、tlh 0.15 μmol/L、ureR 0.80 μmol/L,探针浓度分别为HEX 0.50 μmol/L、FAM 0.50 μmol/L;该方法即使在高浓度的背景细菌存在下,DNA浓度与Ct值均呈良好的线性关系,检出限为1.8×102 拷贝/mL;以完整菌细胞的悬液为模板时,预变性时间为30 min,扩增检测效果与以基因组DNA（gDNA）为模板相当（ΔCt＜1）。本研究建立的三重real-time PCR方法能实现快速定量检测副溶血弧菌,并能有效区分致病性及非致病性副溶血弧菌,为副溶血弧菌的快速定量检测和风险评估提供快速、灵敏、准确的方法。     

副溶血性弧菌实时荧光定量PCR标准模板的构建和检测方法的建立

目的:构建肉制品副溶血性弧菌实时荧光定量PCR的标准阳性模板和检测方法.方法:以副溶血性弧菌toxR基因上特异性片段为目标,设计并合成引物及Taqman探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性.结果:构建出副溶血性弧菌荧光定量PCR检测方法的标准模板并建立了相应的检测方法,获得的标准曲线方程为:Y=-3.151 lgX+42.86,灵敏度40copies/反应体系,对副溶血性弧菌具有特异性,同时,该方法具有良好的重复性,变异系数小于5％.结论:使用基于Taqman探针技术的荧光定量PCR检测方法能够对食品中致病性副溶血性弧菌进行快速、简便、准确、高效的定量检测.     

水产品中副溶血性弧菌实时荧光PCR检测方法

建立了一种特异、灵敏、稳定的副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)致病基因的检测方法。对已建立的副溶血性弧菌致病基因tdh、trh和tlh荧光PCR方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测,以验证该方法的有效性。该方法与副溶血性弧菌反应良好,与其他弧菌属和非弧菌属的6株常见食源性致病菌无交叉反应;检测了6株副溶血性弧菌标准菌株和分离株,3种致病基因检出限分别为tlh 6～43 CFU/mL,tdh 97～1 700 CFU/mL,trh 1 100～4 000 CFU/mL;3种致病基因20次重复组内变异系数在0.96%～1.50%,组间变异系数在2.70%～4.10%。该方法操作简便,特异性强,灵敏度高,能够准确、快速、灵敏地检测水产品中副溶血性弧菌。     

实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌的研究

建立了一种快速检测副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP）的荧光PCR（Real time polymerase chain re-action）方法。首先,从GenBank中获得副溶血性弧菌种特异性基因不耐热溶血毒素基因tl和直接耐热溶血素毒素基因tdh,用Primer Express2.0设计引物和Taqman荧光探针,在Roche荧光PCR上进行荧光PCR扩增,荧光曲线表明该荧光PCR可特异性地检测副溶血性弧菌,而大肠杆菌等其他14种细菌和空白对照都是阴性;检测方法灵敏度达10cfu/reaction。本研究建立的荧光PCR检测副溶血性弧菌的方法快速、特异性强,灵敏度高,稳定性好,可检测出总的和带tdh毒力基因的副溶血性弧菌,适合于大批量样品的检验,可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

荧光PCR检测副溶血性弧菌致病基因方法的建立

建立一种准确、快速、特异地检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)致病基因的荧光PCR方法。方法 用7株已知其致病基因的VP标准菌株和检出菌分别对6种VP致病基因荧光PCR检测文献方法和本文建立的方法进行验证比较,并用6种常见食源性病原菌对新建方法的特异性进行检验。结果 所建方法能够同时检测VP的3种溶血素,其检测结果与菌株的溯源结果及普通PCR结果完全一致,且与常见食源性病原菌无交叉反应。结论 本文建立的荧光PCR体系能够准确、快速、特异地检测VP的致病基因,具有较好的实用性。     

活的非可培养状态副溶血性弧菌实时荧光逆转录PCR检测方法的建立及其毒力研究

目的 建立检测活的非可培养(VBNC)状态副溶血性弧菌的荧光逆转录PCR方法并研究其毒力基因表达.方法 将副溶血性弧菌AS079菌株添加到陈化海水中,4℃冰箱内培养,使其进入VBNC状态,针对其管家基因、鉴定基因和毒力基因分别设计实时荧光逆转录PCR引物,通过不同的PCR反应程序和引物浓度组合试验,摸索最佳反应体系条件,用于VBNC状态副溶血性弧菌的检测和毒力研究.结果 用所建立的检测VBNC状态副溶血性弧菌的实时荧光逆转录PCR方法,对接种于陈化海水培养的不同时期的AS079副溶血性弧菌进行荧光定量逆转录PCR扩增,结果显示,随着培养时间的延长,毒力基因tdh2和鉴定基因toxR表达水平持续下降,但即使细菌进入VBNC状态,这两个基因也能够得到很好的扩增,说明以toxR基因和tdh2基因对进入VBNC状态的副溶血性弧菌进行检测和毒力研究方法可行.灵敏度试验表明,鉴定基因toxR的最低检测限可达到48 cfu/ml,研究毒力基因tdh2的表达需要细菌浓度至少为4.8×102cfu/ml,同时试验证明此方法与其他相近食源性致病菌无交叉反应.结论 该实时荧光逆转录PCR方法检测快速、特异性强、敏感度高,适用于VBNC状态副溶血性弧菌的检测和毒力分析.     

基于内参的副溶血性弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立基于内参的副溶血性弧菌实时荧光定量PCR方法,快速检测样品中的副溶血性弧菌。方法根据Gen Bank已公布的副溶血性弧菌基因组序列,筛选特异性靶基因,设计特异性引物探针,优化反应体系,并在体系中加入内参(IAC),通过标记不同荧光基团的Taq Man探针来监测IAC,进而实时监控整个PCR反应。按照5~50 cfu/25 g的细菌量人工污染样品,以评价所建立反应的体系。结果以副溶血性弧菌基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/μl;以10倍梯度稀释的菌液经水煮法提取的DNA为模板,最低检测限为4×102cfu/ml;以含有gyr B的质粒为模板,最低检测极限可以达到100 copies/μl;建立gyr B和gyr B-IAC标准曲线,Ct值与模板拷贝数均呈良好线性关系(r2=0.999);人工污染初始菌量为7 cfu/25 g时,样品中副溶血性弧菌增菌6 h即可检出。结论本研究所建立的gyr B-IAC实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中副溶血性弧菌,又能实时监测PCR反应过程,有效防止"假阴性"的发生,结果可靠,有利于实现海产品中副溶血性弧菌实时荧光定量PCR检测方法的标准化。     

荧光PCR检测副溶血性弧菌致病性方法的建立

目的 建立一种准确、快速、特异地检测副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）致病基因的荧光PCR方法。方法 用7株已知其致病基因的VP标准菌株和检出菌分别对6种VP致病基因荧光PCR检测文献方法和本文建立的方法进行验证比较,并用6种常见食源性病原菌对新建方法的特异性进行检验。结果 所建方法能够同时检测VP的3种溶血素,其检测结果与菌株的溯源结果及普通PCR结果完全一致,且与常见食源性病原菌无交叉反应。结论 本文建立的荧光PCR体系能够准确、快速、特异地检测VP的致病基因,具有较好的实用性。     

副溶血性弧菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立

以副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)gyr B基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence single primer isothermal amplification,实时荧光SPIA)检测副溶血性弧菌的方法。实时荧光SPIA在40 min反应时间内,对3株副溶血性弧菌和16株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA检测,结果表明除3株副溶血性弧菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌纯培养DNA的灵敏度为8.2 fg/μL,对副溶血性弧菌菌悬液的检测灵敏度为13.5 CFU/m L;对鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋等4种模拟样品中副溶血性弧菌的检出限均为14.7 CFU/g。研究结果表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便。     

副溶血弧菌的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法建立

基于副溶血弧菌gyrB基因保守序列设计1对特异性引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测副溶血弧菌的方法。SYBR GreenⅠ实时定量PCR的Tm为90℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性;所制作的实时定量PCR扩增标准曲线在2.06×108～2.06×103拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.992,能对副溶血弧进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,且较传统方法敏感、操作简单,可用于针对副溶血弧菌的进出口检验检疫、食品安全检测及该菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。     

副溶血弧菌的多重PCR检测

副溶血弧菌是一种致病性弧菌,毒力因子主要有不耐热溶血毒素、耐热直接溶血毒素和相对耐热直接溶血毒素三种。本实验根据FDA标准推荐的引物对其进行了检验,发现副溶血弧菌环境分离株中没有耐热直接溶血毒素和相对耐热直接溶血毒素基因,仅有不耐热溶血毒素基因。     

沙门氏菌及副溶血性弧菌的共增菌培养基的研制

为研制一种可同时富集沙门氏菌和副溶血性弧菌的增菌培养基,参照GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013规定的增菌培养基成分,并根据目标菌不同的营养需求,筛选适宜抑制剂和促进剂,进行单因素实验,确定共增菌培养基的配方,并验证该培养基的增菌效果。结果表明:研制出用于沙门氏菌和副溶血性弧菌的共增菌培养基成分为:蛋白胨10.0 g,磷酸二氢钾1.5 g,氯化钠7.5 g,硫代硫酸钠5.0 g,牛胆盐0.1 g,柠檬酸钠2.5 g,甘露醇2.5 g,葡萄糖2.5 g,蒸馏水1000 mL。目标菌初始接种量为10² CFU/mL,在37 ℃下培养16 h后,两种目标菌的菌浓度可达到10⁷~10⁸ CFU/mL。结果表明,共增菌培养基可用于沙门氏菌和副溶血性弧菌的富集培养,培养基配制简易,节约成本,具有良好的市场前景。     

基于弧菌毒力基因多重PCR法的建立及其在副溶血弧菌毒力基因检测中的应用

针对副溶血弧菌常见的11种毒力基因(tox R、Collagenase、tox S、trh、tdh、tlh、Ure R、Fla A、omp W、Asp A、fur),建立了两套六重PCR检测体系,应用于副溶血弧菌环境分离株和水产品分离株的毒力基因分布情况调查。在调查的248株副溶血弧菌中,鞭毛丝蛋白基因Fla A、外膜蛋白基因omp W和铁吸收调节蛋白基因fur的分布最广(100%),其次为碱性丝氨酸蛋白酶基因Asp A(99.60%),胶原蛋白酶基因Collagenase、不耐热性溶血毒素基因tlh以及毒力调控基因tox R和tox S的分布率均在90%以上且tox R和tox S的分布极为相似,尿素酶基因Ure R的分布极少(1.21%),而耐热直接溶血素基因tdh和耐热相关溶血素基因trh在这248株副溶血弧菌中没有检出。本研究建立的多重PCR检测体系能快速、高效地检测多个毒力基因的分布情况,为副溶血弧菌的毒力机制研究和风险评估提供方法和依据。     

三文鱼来源副溶血性弧菌的血清分型、毒力基因及耐药性研究

目的 对2019年广州市售三文鱼中副溶血性弧菌的血清型、毒力基因分布及耐药特征进行研究,为防控因食用三文鱼引起副溶血性弧菌食源性疾病提供数据支持。方法 根据GB 4789.7—2013方法对90份广州市售三文鱼样品进行副溶血性弧菌分离、定量及血清分型,分离株的鉴定及耐药性分析采用全自动微生物鉴定仪分析,通过PCR扩增对毒力基因进行检测。结果 90份三文鱼样品中,有16份检出副溶血性弧菌,总检出率为17.78%,阳性样品污染量范围为3.6~93 MPN/g,其中批发市场的检出率（27.50%）最高。MPN计数阳性管分离得到的72株副溶血性弧菌经血清凝集共分出11个O群血清型,分型率为80.56%,其中O11、O9和O6群为主要血清型,占51.39%,其他血清型分布较分散。72株副溶血性弧菌均含有tlh基因,且均未检测到trh和tdh基因。药敏分析发现,全部分离株对碳青霉烯类、单酰胺环类、氨基糖苷类、喹诺酮类和硝基呋喃类等5类18种抗生素敏感。分离株对氨苄西林高度耐药,耐药率达97.22%,少数分离株对哌拉西林（1.39%）和复方新诺明（5.56%）耐药。6.94%的分离株同时对2种抗生素耐药,未出现多重耐药。结论 广州市售三文鱼受到副溶血性弧菌污染程度较高,分离株的血清型呈多样化,主要为非致病株,但具有一定程度的耐药,存在危害健康的潜在风险。     

副溶血弧菌耐药及其机制的研究进展

副溶血弧菌是引起食源性疾病的主要致病菌之一,也给水产品养殖业造成重大经济损失。临床和养殖业者一般使用抗菌药物治疗副溶血弧菌引起的感染,但由于抗菌药物的不规范使用,导致耐药性副溶血弧菌的大量出现。耐药性副溶血弧菌可以通过食物链传播给人类,严重威胁人民群众的食品安全和身体健康。目前,文献报道关于副溶血弧菌耐药谱分析的较多,但关于耐药基因和相关移动元件、耐药机理的研究较少。本文综述了世界上多个国家副溶血弧菌耐药性的情况及其耐药机理的研究现状,并对发展前景进行了分析。     

副溶血性弧菌毒性相关因子及其外分泌蛋白的研究进展

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌,已成为我国沿海地区微生物性食物中毒事件的首要风险因子。该菌主要通过分泌胞外蛋白和毒性因子进入胞外环境或者直接注入宿主靶细胞内,从而使宿主致病。本文主要从副溶血性弧菌毒性相关因子及其分泌系统相关分泌蛋白进行概述,概括阐明近年来针对该菌毒性及分泌蛋白的相关研究进展,并对今后分泌蛋白的研究方向进行了初步探讨。     

副溶血性弧菌微滴数字PCR定量方法的建立

目的:采用微滴式数字PCR技术(Droplet digital PCR,ddPCR),建立副溶血性弧菌快速定量检测。方法:以副溶血性弧菌TLH基因为靶基因,验证确定ddPCR方法的特异性及定量检测的线性范围,以常检出副溶血性弧菌的海产品鳕鱼为样品进行阳性添加,确定方法的可行性。结果:本试验中采用ddPCR检测得到副溶血性弧菌特异性好,有效基因组DNA浓度范围为2~19440拷贝/20μL,分析得菌悬液浓度为50~4.86×10⁵ CFU/mL,与3M测试片所得菌悬液浓度无显著性差异(p>0.05),与荧光PCR相比,可以进行更低浓度检测且能准确定量。结论:副溶血性弧菌ddPCR定量检测技术特异性良好、灵敏度高、结果准确,具有实际应用价值。     

脉冲强光对副溶血性弧菌的杀菌效果及动力学

为了描述脉冲强光杀菌过程和预测杀菌效果,建立了脉冲强光对副溶血性弧菌的杀菌动力学模型。采用单次辐照剂量为67、92、113 mJ/cm²分别处理3.0%氯化钠体系中副溶血性弧菌0~25 s,考察其杀菌效果。选取Linear、Weibull和Log-logistic三种数学模型来拟合脉冲强光杀菌的动力学过程,以精确因子(A_f)、偏差因子(B_f)、根平均方差(RMSE)和决定系数(R²)作为模型拟合度优劣评价指标。结果表明,当辐照距离为30 cm,单次辐照剂量为113 mJ/cm²处理时间为25 s时,副溶血性弧菌减少5.63 logCFU/mL,杀菌率为99.96%;Weibull模型和Log-logistic模型较Linear模型能更好的拟合脉冲强光处理副溶血性弧菌的杀菌曲线,Weibull模型能最好地拟合脉冲强光杀菌的动力学过程,且相较Log-logistic模型更简洁、灵活实用。     

双层平板直接定性定量法检测海产品中副溶血性弧菌

目的:建立一种直接定量定性检测海产品中副溶血性弧菌的方法。方法:参照国标菌落计数方法,筛选具备计数和显示副溶血性弧菌典型菌落颜色功能的培养基,将人工染菌样品分别置于50、4和-18℃温度下并分别进行测试。结果:在NaCl NA双层平板上副溶血性弧菌菌落呈淡紫色,在人工染菌样品实验中与NaCl NA平板计数无显著差异;NaCl NA双层平板直接定量检测4℃冷藏处理和-18℃冷冻的样品中副溶血性弧菌浓度分别是对照组的68.9%和21.7%。结论:NaCl NA双层平板法具备操作简便、检验周期短、结果稳定、灵敏度高等特点,适合应用于-18~50℃温度环境下放置的海产品中副溶血性弧菌直接定性定量检测,能如实反映样品受污染的情况。