产气荚膜梭菌肠毒素基因地高辛探针制备与检测方法建立的初步研究

产气荚膜梭菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ,ＣＰ）是人类和家畜重要的厌氧性病原菌,产生肠毒素的ＣＰ是人类食物中毒病原菌。本研究用地高辛标记肠毒素基因制备探针,并建立了原位杂交检测方法,直接检测肠毒素基因（ｃｐｅ）。这是继ＰＣＲ检测方法后又一项特异性基因诊断技术。由于利用了光学显微镜观察结果,形态学上比较直观,增加了实验的准确性。与ＰＣＲ、乳胶凝集相比,原位杂交检测方法具有较高的敏     

肉类食品中产气荚膜梭菌及其控制研究进展

产气荚膜梭菌广泛存在于自然界,且可以形成芽孢,是导致肉类食物中毒和气性坏疽等的主要病原菌。本文综述了肉类食品中产气荚膜梭菌的污染情况、生长影响因素以及控制其生长的方法;指明了利用食用安全的天然物质,研发高效抑制产气荚膜梭菌生长的技术与方法,对保障肉制品安全和促进肉类工业健康发展的现实意义,旨在为人们选择适合肉类食品中抑制产气荚膜梭菌生长的途径提供参考。     

郑州市熟肉制品中产气荚膜梭菌污染状况调查

目的了解郑州市熟肉制品中产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的污染状况,为熟肉制品储存过程中产气荚膜梭菌的安全控制提供技术支撑。方法按照GB 4789.13—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验》中的方法分别对11种不同样品进行检测分析,结合VITEK鉴定法和分子生物学鉴定法进一步验证。结果 259份样品中,产气荚膜梭菌检出份数为38份,总检出率14.7%,不同样品的检出率范围为0.0%~33.3%,其中盐焗鸡样品检出率最高为33.3%(7/21),卤半片鸭和卤鸡肝样品未检出。烧鸡、烤鸡和卤鸡腿样品的产气荚膜梭菌菌落总数均超过5.0log10CFU/g,其他样品的菌落总数均在4log_(10)~5log_(10) CFU/g之间。结论郑州市熟肉制品中的产气荚膜梭菌污染现象较严重,烧鸡、烤鸡和卤鸡腿的菌落总数较高,有引起食物中毒的可能。     

产气荚膜梭菌质控样品的研制

目的 制备产气荚膜梭菌质控菌株质控样品.方法 将产气荚膜梭菌菌悬液于36℃厌氧培养至浓度为107 CFU/mL,以10％(m/m,下同)脱脂奶粉、5％海藻糖、5％蔗糖、1％谷氨酸钠、0.5％抗坏血酸钠为菌体保护剂,使用冷冻干燥法制备冻干菌剂.依据CNAS-CL03-A001:2019《能力验证提供者认可准则在微生物领域...     

荧光MIRA法快速检测食品中产气荚膜梭菌

目的 基于荧光多酶恒温快速扩增（MIRA）技术,建立一种快速准确检测食品中产气荚膜梭菌的方法。方法 利用产气荚膜梭菌共有α毒素编码基因plc保守序列设计引物探针,并建立和优化荧光MIRA方法;提取17种非目标菌基因组DNA进行方法特异性验证;梯度稀释目标菌基因组DNA和菌液用于方法灵敏度评价;选取4种食品进行基质干扰试验,评估方法的稳定性;检测实际样品并与国家标准方法进行比较,以验证该方法的实用性。结果 该方法特异性强,检测多种非目标致病菌均呈阴性反应;灵敏度高,以基因组DNA为模板和菌液为模板时最低检测限分别为1.05×101 fg/μL和7.5×100 CFU/mL;该方法不受基质影响,抗干扰能力强;耗时短,约20 min即可完成检测。结论 本研究中的荧光MIRA方法快速准确、灵敏度高、特异性强,可用于食品中产气荚膜梭菌的快速检测。     

环介导等温扩增技术快速检测产气荚膜梭菌的研究

目的:建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测产气荚膜梭菌的方法。方法:以产气荚膜梭菌(ATCC13124)的α毒素全基因序列为保守序列,设计内、外、环引物,肉眼观察白色沉淀并判断检测结果。结果:LAMP检测产气荚膜梭菌的灵敏度为2.92×102CFU/mL,人工污染产气荚膜梭菌的全脂乳的检测限为15.7CFU/mL,耗时仅1h。对照PCR检测产气荚膜梭菌的灵敏度为2.92×105CFU/mL,人工污染产气荚膜梭菌的全脂乳的检出限1.57×105CFU/mL。采用同样的方法提取DNA,耗时3h。结论:建立LAMP快速、特异检测产气荚膜梭菌的方法,该方法灵敏度是PCR的1000倍,为食品中产气荚膜梭菌的检测构建了一个技术平台。     

聚赖氨酸对产气荚膜梭菌的抑菌研究

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是真空包装熟肉制品中最常见的一种厌氧污染菌。研究表明,ε-聚赖氨酸对其具有很强的抑制作用,在最适抑菌pH下(pH6.5),ε-聚赖氨酸对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.025%;高价金属阳离子对ε-聚赖氨酸的抑菌活性有明显的抑制作用,而EDTA则可以络合高价金属离子,增强其抑菌作用。将0.01%的EDTA和0.01%的ε-聚赖氨酸复合使用时可完全抑制产气荚膜梭菌的生长繁殖。     

聚赖氨酸对产气荚膜梭菌的抑菌研究

产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）是真空包装熟肉制品中最常见的一种厌氧污染菌。研究表明,ε-聚赖氨酸对其具有很强的抑制作用,在最适抑菌pH下（pH6.5）,ε-聚赖氨酸对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.025%;高价金属阳离子对ε-聚赖氨酸的抑菌活性有明显的抑制作用,而EDTA则可以络合高价金属离子,增强其抑菌作用。将0.01%的EDTA和0.01%的ε-聚赖氨酸复合使用时可完全抑制产气荚膜梭菌的生长繁殖。      

产气荚膜梭菌在食品中的危害及其控制研究进展

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种革兰氏阳性厌氧芽孢致病菌,广泛分布于环境、动物以及人类的胃肠道中,因能分解肌肉和结缔组织中的糖类并产出大量气体以及形成荚膜而得名.其对生长环境要求较低,是自然界中常见的致病菌.其芽孢是在环境胁迫(低温、干燥或营养缺乏等)下形成的一种微生物休眠体,具有极...     

一起疑似产气荚膜梭菌食物中毒事件的病原学分析

目的 分析一起疑似产气荚膜梭菌食物中毒事件的病原学。方法 利用荧光定量PCR方法对一起食物中毒患者的粪便进行产气荚膜梭菌基因的初筛, 根据荧光定量PCR初筛的提示结果进行细菌的分离培养, 对分离到的菌株进行质谱和生化鉴定、毒力基因检测和PFGE分析。结果 从5份食物中毒患者粪便中分离到5株携带肠毒素基因cpe的A型产气荚膜梭菌, 并且这5株菌的PFGE带型完全一致。结论 此次食物中毒致病因子为携带肠毒素基因cpe的A型产气荚膜梭菌, PFGE结果提示5株菌可能有同一来源。     

贵州省一起产气荚膜梭菌引起食源性疾病暴发事件的调查及病原体溯源

目的 对贵阳市某学校由产气荚膜梭菌引起发的食源性疾病暴发事件开展流行病学调查和病因食品和病原的溯源分析,探讨全基因组测序新技术在食源性疾病暴发溯源中的应用。方法 采用现场流行病学分析,采集可疑生物样本,食品样本和外环境样本进行常规的实验室病原分离及沙门菌、致泻大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和产气荚膜梭菌的病原鉴定。对分离的病原菌进行毒素基因检测和全基因组测序溯源分析。结果 22名病例症状以腹痛（95.45%,21/22）、腹泻（95.45%,21/22）为主;流行曲线为点源暴露模式,潜伏期为6-15 h。在5份肛拭子样本、3份粪便样本和1份留样早餐肉末食品样本中分离出产气荚膜梭菌,且均检出肠毒素cpe基因,所有样本均未检出沙门菌、致泻大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。其中早餐肉末食品样品中经全基因组测序分析对比发现产气荚膜梭菌为3.5×10⁵ CFU/g,经全基因组测序分析比对发现,来源于早餐肉末食品和肛拭子样本的产气荚膜梭菌,其分子分型为ST139型,菌株均携带cpe毒力基因。结论 通过现场调查和溯源分析,判定产气荚膜梭菌污染早餐肉末是导致此次食源性疾病暴发的原因。全基因组测序新技术在食源性疾病暴发中可起到精准溯源作用。     

一起疑似产气荚膜梭菌腹泻暴发事件实验室检测分析

目的 分析一起疑似由产气荚膜梭菌导致腹泻暴发事件的实验室检测结果,为产气荚膜梭菌食物中毒实验室检测策略的改进奠定基础。方法 采集暴发事件中4例病例肛拭子样本,应用荧光PCR方法检测肛拭子及其增菌液中cpa基因与cpe基因。对肛拭子样本进行产气荚膜梭菌分离培养,对部分分离单菌落进行产气荚膜梭菌毒力基因检测和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型。结果 4例病例样本中均检测到cpa基因和cpe基因。从病例1样本中挑取并鉴定为产气荚膜梭菌的18个单菌落中获得1个cpe+菌落,构成比为5.56%（1/18）;从病例2样本中挑取并鉴定为产气荚膜梭菌的6个单菌落中获得1个cpe+菌落,构成比为16.7%（1/6）;病例3未分离到cpe+菌落,病例4未分离到产气荚膜梭菌。11株产气荚膜梭菌菌株包括A型和C型两种,包含5种PFGE带型,分离自病例1和病例2的cpe+阳性菌株PFGE带型一致。结论 本次暴发事件可能由产气荚膜梭菌导致,综合使用各种实验室检测方法可在产气荚膜梭菌诊断标准滞后的情况下协助暴发事件分析。     

某企业婴儿肉毒中毒乳粉相关样品中肉毒梭菌的分离与分型

目的 对从某企业获取的30批次婴儿配方乳粉样品进行肉毒毒素和肉毒梭菌检测,对分离到的1株B型肉毒梭菌进行全基因组测序分析。方法 参照GB 4789.12—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验》对样品进行肉毒梭菌分离及肉毒毒素分型实验;对分离到的菌株进行全基因组测序,并分析菌株的遗传特征。结果 30批次样品中均未检出肉毒毒素;将增菌液进行小鼠腹腔注射后,4批次乳粉样品出现了典型小鼠肉毒中毒症状,但仅从1批次乳粉样品中分离到肉毒梭菌。基因组测序分析显示,该菌为Ⅰ群B型肉毒梭菌,毒素基因簇为Ha型,毒素基因为B2亚型。结论 针对背景微生物复杂的婴儿配方乳粉中肉毒梭菌检测,不应以菌种分离作为金标准,而应以增菌液小鼠毒性实验结合肉毒抗血清保护实验作为确认方法。全基因组测序可对分离菌种进行精准鉴定和相关遗传特征分析,为中毒事件处理提供可靠的技术支撑。     

Growth of Clostridium perfringens from spore inocula in cooked cured beef: development of a predictive model

The objective of this study was to develop a model to predict the growth of C. perfringens from spores at temperatures applicable to the cooling of cooked cured meat products. C. perfringens growth from spores was not observed at a temperature of 12 °C for up to 3 weeks. The two parameters: germination, outgrowth, and lag (GOL) time and exponential growth rate, EGR, were determined using a function derived from mechanistic and stochastic considerations and the observed relative growths at specified times. A general model to predict the amount of relative growth for arbitrary temperature was determined by fitting the exponential growth rates to a square root Ratkowsky function, and assuming a constant ratio of GOL and generation times. The predicted relative growth is sensitive to the value of this ratio. A closed form equation was developed that can be used to estimate the relative growth for a general cooling scenario and determine a standard error of the estimate. The equation depends upon microbiological assumptions of the effect of history of the GOL times for gradual changes in temperature. Applying multivariate statistical procedures, a confidence interval was computed on the prediction of the amount of growth for a given temperature. The model predicts, for example, a relative growth of 3.17 with an upper 95% confidence limit of 8.50 when cooling the product from 51 to 11 °C in 8 h, assuming a log linear decline in temperature with time.     

产气荚膜梭菌磷脂酶C的重组表达及其脱胶应用

将产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)磷脂酶C(Cp-PLC)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了重组表达,并对重组Cp-PLC表达条件进行了优化。结果表明:当菌体生长至OD600为1.0时,添加8 g/L乳糖在30℃下诱导32 h,得到的重组Cp-PLC的酶活最大,为398.35 U/mL;重组Cp-PLC用于菜籽毛油脱胶的最佳条件为温度57℃、pH 5.0、加酶量600 U/kg、反应时间1.5 h;在最佳条件下,菜籽毛油的磷含量可降至5.66 mg/kg,能够满足物理精炼的要求。     

1959—2022年青海省食源性肉毒中毒事件流行病学分析

目的 分析青海省食源性肉毒中毒事件流行特征及影响因素,为防控提供科学依据。方法 收集1959—2022年青海省肉毒中毒数据,应用Excel 2021进行流行病学特征分析,利用R 4.2. 3对事件数和病死率进行Mann-Kendall趋势检验,运用ArcGis 10.2软件制作空间分布图。结果 1959—2022年发生食源性肉毒中毒事件86起,发病348人,死亡195人,病死率为56.03%。中毒主要发生在第二、三季度,牧民为主要的发病人群,肉毒毒素型别主要为E型,“风干肉”为主要的中毒食品,生食和开锅即食为主要的食用方式。结论 青海省食源性肉毒中毒病死率整体呈下降趋势,发病地区也逐渐缩小,但作为我国高发地区之一,病死率仍处于较高水平,应进一步加强对高危人群食品安全教育,提高基层医疗机构对肉毒中毒的救治能力,减少中毒事件的发生和死亡。     

Use of γ-irradiation to reduce Clostridium perfringens on ready-to-eat bovine tripe

The aim of this study was to determine the effect of gamma irradiation at a target dose of 9kGy and storage at 5 and 15°C on the safety of ready-to-eat (RTE) tripe with respect to Clostridium perfringens count (CC) and aerobic plate count (APC), and to determine the effect of boiling (1h) and irradiation (9kGy) on Cl. perfringens ATCC 13124 spore structure. Irradiation significantly reduced APC stored at 5 and 15°C for 7 days. However, 0kGy control samples increased in their APC to >7log(10) cfu/g throughout 7 days of storage. Irradiation eliminated the inoculated Cl. perfringens ATCC 13124 spores on RTE tripe throughout storage at 5 and 15°C. Transmission electron microscopy of Cl. perfringens ATCC 13124 spores showed that boiling caused a reduction in spore material, irradiation caused elongation of the Cl. perfringens ATCC 13124 spores, and boiling in combination with gamma irradiation caused loss of spore material. Therefore, irradiation at 9kGy, together with storage at 5°C, can assure the microbiological safety of RTE bovine tripe, with respect to Cl. perfringens spores for at least 7 days at 5 and 15°C.     

Nachweis und Charakterisierung von Clostridium perfringens mittels real-time-PCR

Clostridium perfringens is a Gram-positive, anaerobic bacterium. The strains are classified into five types (type A to E), depending on the ability to produce alpha-, beta-, epsiloon and iota-toxin, but food-poisonings are mostly caused by C. perfringens type A isolates. Ingestion of contaminated food is followed by gastrointestinal disease, when enzyme-resistant C. perfringens enterotoxins (CpE) are set free during sporulation. In most cases the bacterium has to grow up to more than 10⁶ cfu/g food to cause a gastrointestinal disease (BVET, 2005; BfR, 2005). Cultural methods, normally used for the detection of C. perfringens, are not able to differentiate isolates into the five different toxin types. This is the reason, why the detection of C. perfringens in food under the present legal regulations can only used as an indication for inadequate production hygiene or a toxin-infection with contaminated food as source. For the detection of the toxin genes to differentiate C. perfringens in five different toxin types, three duplex real-time-PCR assays for the routine diagnostic were developed and validated. The assays can be used for quick detection and easy classification of C. perfringens isolates and as a rapid screening-system in suspected cases of C. perfringens food-poisonings.

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Zuszammenfassung:  Clostridium perfringens geh?rt zur Gruppe der gram-positiven, anaerob bzw. aerotolerant wachsenden Bakterien. Abh?ngig von der F?higkeit der einzelnen C. perfringens St?mme, alpha-, beta-, epsilon und iota-Toxin zu bilden, erfolgt eine Einteilung in die Typen A bis E, wobei C. perfringens Typ A für den überwiegenden Teil der lebensmittelassoziierten menschlichen Erkrankungen verantwortlich ist. Ursache solcher Toxin-Infektionen ist das erst im Darm im Rahmen der Sporulation der mit den Lebensmitteln aufgenommenen vegetativen Zellen gebildete Enterotoxin (CpE). In der Regel muss sich der Erreger im Lebensmittel auf mehr als 10⁶ KbE/g Lebensmittel vermehren, damit beim Konsumenten eine Erkrankung ausgel?st wird (BVET, 2005; BfR, 2005). Da die derzeit vorhandenen kulturellen Nachweisverfahren keine M?glichkeit bieten, die gewonnenen Isolate einem bestimmten Toxintyp zuzuordnen, kann der Nachweis von C. perfringens in einem Lebensmittel nach gültiger Rechtslage lediglich als ein Hinweis auf eine mangelhafte Produktions- oder Verarbeitungtechnologie oder auf das Vorliegen einer lebensmittelbedingten Toxin-Infektion gewertet werden. Zum Nachweis der Toxingene, die eine Einteilung von C. perfringens in die fünf verschiedene Toxintypen erm?glichen, wurden drei Duplex-real-time-PCR-Assays etabliert und die Einsatzm?glichkeiten in der Routinediagnostik getestet. Die Systeme sollen für einen schnellen Nachweis und eine rasche Differenzierung von C. perfringens sowie als Screening-System bei Verdacht auf eine lebensmittelbedingte Erkrankung genutzt werden.

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Eingegangen: 30. Januar 2007