重组大肠杆菌制备副溶血弧菌噬菌体内溶素Lys qdvp001 CHAP域及诱导条件初步优化

目的:为了利用噬菌体内溶素防控副溶血弧菌,通过克隆表达工程菌pET30a-CHAP制备目的蛋白,并将以包涵体存在的目的蛋白复性得到有活性的噬菌体内溶素蛋白。方法:首先克隆工程菌pET30a-CHAP,经 IPTG的诱导表达后,检测菌液上清中内溶素含量判断表达形式,再进行诱导条件初步优化。通过将表达的pET30a-CHAP包涵体蛋白先用洗涤剂洗涤去除杂蛋白,然后用尿素变性剂溶解,并用Ni²⁺ Sepharose^TM 6 Fast Flow亲和层析柱进行层析纯化,用EDTA、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽等为折叠复性促进剂,经过透析制备可溶性的 pET30a-CHAP蛋白,再检测目的蛋白的抑菌活性。结果:本实验确定了重组菌内溶素的表达形式为没有活性的包涵体;初步确定最佳诱导条件为诱导温度为16 ℃,IPTG终浓度0.5 mmol/L,诱导时间为7 h;复性后的内溶素具有抑菌活性。结论:本研究为利用内溶素防控副溶血弧菌以及其他革兰氏阴性细菌提供了制备方法。     

重组人骨形成蛋白-2基因工程菌株的构建及蛋白复性纯化

目的构建一株高效表达人骨形成蛋白2(hBMP-2)的基因工程菌株,并通过复性、纯化获得有生物活性的rhBMP-2。方法采用基因工程法将hBMP-2基因片段与pET-28a(+)质粒载体相连,构建大肠杆菌表达系统。工程菌发酵后,超声破碎收集包涵体,包涵体经裂解后通过稀释复性法进行复性,SDS-PAGE检测复性情况,并采用HiTrap Heparin HP纯化,C2C12细胞检测活性。结果 rhBMP-2在大肠杆菌中以无活性的包涵体形式表达,1 L发酵罐高密度发酵rhBMP-2包涵体湿重可达20 g/L。采用稀释法复性,蛋白复性率大于40%,亲和层析纯化后,二聚体蛋白纯度达95%以上,且能诱导C2C12细胞碱性磷酸酶的表达,具有同市售产品相同的细胞活性。结论成功构建了高效表达rhBMP-2的基因工程菌株,复性方法简单且无需对包涵体进行纯化,蛋白复性浓度高,纯化方法简便,大大降低了工业化生产成本。     

大肠杆菌重组几丁质酶的表达、包涵体复性及酶学性质研究

通过研究重组几丁质酶在大肠杆菌表达系统中诱导表达的浓度、时间和温度,获得表达的最佳条件。表达产物除了可溶性目的蛋白以外,仍存在于包涵体中。采用透析复性和Ni-NTA亲和层析柱上复性两种方法对包涵体中的目的蛋白进行复性,并比较对目的蛋白产率和比酶活的影响。并考察了亲和层析柱上复性时的上样量、洗脱速率和温度对酶活的影响。结果发现,表达的几丁质酶可以采用透析和亲和层析柱上复性,亲和层析柱上复性的比酶活为1347.7 U/mg,明显高于透析复性,但产率明显低于透析复性。对1 m L的Ni-NTA亲和层析柱,较低浓度的蛋白复性液在0.4 m L·min-1洗脱速率下,降低上样量和温度,可以提高复性效率。复性后的几丁质酶对荧光底物具有较高活性,反应的最适温度为37℃,最适p H为3.8。      

原核表达抗克伦特罗重组单链抗体及其纯化研究

目的:原核表达抗克伦特罗重组单链抗体,对表达的包涵体蛋白进行提取和纯化,并鏊定重组抗体特性.方法:通过温度诱导大肠杆菌表达抗克伦特罗单链抗体,超声破碎菌体细胞,采用不同洗涤溶液提取包涵体.以不同变性剂溶解包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化后,经脉冲稀释法将其复性.超滤及透析浓缩蛋白复性液,经Ni-NTA亲和柱二次纯化,得到纯化重组目的蛋白.通过SDS-PAGE电泳分析重组目的蛋白纯度,采用Western bloning和间接竞争EUSA对所制备的抗克伦特罗重组单链抗体特异性进行鉴定.结果:以大肠杆菌Es-cherichia coli BL21(DE3)为宿主菌诱导表达重组单链抗体,产率最高,占菌体蛋白的31%.以1 mol/L尿素洗涤包涵体,6 mol/L盐酸胍为变性剂,经Ni-NTA亲和柱纯化,所得复性重组单链抗体蛋白的纯度达96%.Western blotting分析显示,纯化并复性后的单链抗体可与鼠抗His标签蛋白单克隆抗体发生特异性的结合反应.间接竞争ELSIA结果表明,该重组抗体IC50值为3.35 ng/mL,与沙丁胺醇等结构类似物无交叉反应.结论:原核表达制备的抗克伦特罗重组单链抗体具有较好的抗原结合活性及特异性,为进一步开展克伦特罗的免疫快速检测研究奠定基础.     

群体感应淬灭酶LsrK蛋白表达纯化

对群体感应淬灭酶LsrK蛋白进行重组表达及纯化。构建重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-28a-lsrK,利用乳糖自诱导的方法诱导表达重组蛋白LsrK,并利用亲和层析和凝胶过滤层析进行纯化。LsrK蛋白经凝胶过滤层析后,纯度较高,蛋白浓度达到28.6mg/L发酵液,为进一步进行LsrK蛋白的结构解析及功能研究奠定了基础。     

海洋假单胞杆菌褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的高效表达和活性检测

利用PCR方法从假单胞杆菌基因组DNA扩增胞外褐藻胶裂解酶的全基因和缺损片段,构建表达质粒pQE30-aly32和pQE30-aly165,并在大肠杆菌M15中成功表达。表达的重组蛋白大部分存在于包涵体中,经洗涤,变性和复性,镍柱亲和层析纯化,获得了电泳纯的Aly32和Aly165。酶活性检测发现,仅Aly165具有较强活性,108 u/mg,该酶对poly(G)和poly(M)都有活性,对poly(M)更敏感。对表达体系进行优化,确定IPTG的最佳浓度为0.6mmol/L,最佳诱导菌液密度OD600为0.5~0.6,最佳表达时间为3h,28℃低温诱导可以提高重组蛋白的可溶性,可溶性蛋白相对表达量达到25%。     

重组牛乳铁蛋白肽包含体的复性与纯化

通过分析透析液pH值，包含体蛋白浓度，DTT浓度3个参数对复性率的影响，确定了重组牛乳铁蛋白N-末端多肽（pGEX-4T1／rbLF—N）包含体透析复性的最佳条件和复性后蛋白纯化的适宜方法。采用谷胱甘肽琼脂糖凝肢4B柱（Glutathione Sapharose^TM 4B）时复性后的蛋白溶液进行纯化．纯化后的融和蛋白经胃蛋白酶酶解并检测其酶解产物的抗菌活性。试验表明包涵体蛋白可以部分复性。当pH值为8．5，包含体蛋白质量浓度为100mg／L，DTT浓度为24mmol／L，包含体的复性率最高。纯化后的融合蛋白酶解产物具有抗菌作用。     

草鱼潜在过敏原α-烯醇化酶原核表达条件的优化

目的 通过对草鱼α-烯醇化酶(α-Enolase)原核表达的条件进行优化,分别从表达的上清液与包涵体中纯化获得重组α-Enolase。方法 本研究基于前期克隆的草鱼α-Enolase基因序列设计表达引物,将草鱼α-Enolase基因克隆至pET-30a质粒中,得到pET-30a-α-Enolase重组质粒。然后,将重组质粒转入大肠杆菌Origami2(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行体外诱导表达。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳方法分析重组蛋白的可溶性,并对表达条件进行优化。利用亲合层析法纯化目的蛋白。结果 在20℃诱导15 h得到的重组蛋白以两种形式存在:一部分为可溶性蛋白存在于上清液中,一部分以包涵体形式存在于沉淀中;在37℃诱导4h得到的重组蛋白则只有包涵体形式。包涵体蛋白表达量最大的优化条件为:诱导温度为37℃, IPTG终浓度1.0 mmol/L,诱导时间4 h。采用亲合层析法分别纯化上清液(20℃诱导15 h)和包涵体中(37℃诱导4 h)的重组蛋白,得率分别为3...     

噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌基因crtE编码GGPP合成酶。通过PCR扩增获得crtE基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtE。重组质粒转化E.coli BL21(DE3),构建工程菌;重组GGPP合成酶在大肠杆菌中实现了高效表达,表达量占菌体总蛋白的42%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子亲和层析树脂纯化,得到了电泳纯的重组噬夏孢欧文氏菌GGPP合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为34kDa,pI值为6.3。     

重组人SOD2/3杂合酶原核表达及纯化方法的研究

目的摸索工程菌的表达条件并分离纯化,获得高活性的重组人SOD2/3杂合酶(rhSOD2/3)。方法利用含有质粒pET-28a-SOD2/3的工程菌诱导表达rhSOD2/3,考察诱导温度、诱导剂浓度、Mn2+浓度与加入时机对重组酶表达量与活性的影响;利用金属螯合亲和层析纯化rhSOD2/3。结果重组酶的表达量占菌体总蛋白40%~50%,最佳表达温度15℃、诱导剂浓度0.5 mmol/L,Mn2+浓度2.5 mmol/L,表达时间16 h,亲和层析能较好的纯化rhSOD2/3,比活从粗酶液220 U/mgpr提高到930 U/mgpr以上。结论成功获得了rh SOD2/3最适的表达条件及纯化方法。     

植物乳杆菌重组亚油酸异构酶的表达与纯化

对转化有植物乳杆菌亚油酸异构酶基因的大肠杆菌进行诱导表达,表达出大量重组亚油酸异构酶蛋白,但大部分目的蛋白形成了包涵体,用8mol/L尿素将包涵体蛋白溶解变性后,用金属螯合层析对重组蛋白进行了纯化.当咪唑溶液浓度为50mmol/L时,重组蛋白开始被洗脱下来;当咪唑溶液浓度为200mmol/L时,蛋白洗脱效果最佳;浓度为400mmol/L时,重组蛋白完全被洗脱下来.纯化后重组蛋白的收率为84.71%.     

变形链球菌UA159葡萄糖基转移酶B催化活性区的基因克隆及表达

为获得具有良好生物活性的可溶性葡萄糖基转移酶催化活性区(GTFB/CAT),根据NCBI上已发表的Streptococcus mutans UA159(血清型c)GTFB的DNA测序结果,按照GTFB/CAT两端的序列设计引物,利用PCR克隆技术钓取S.mutans UA159(血清型c)的GTFB/CAT基因,连入表达载体p ET-28b(+)中构成p ET-28b(+)-GTFB/CAT重组体,将重组载体转入大肠杆菌BL21(E.coil BL21)宿主菌中进行诱导表达,最佳诱导条件为37℃或30℃、4 h、诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L,产物经Ni2+-NAT树脂亲和层析纯化,得到了不可溶的GTFB/CAT包涵体,包涵体通过变性-复性最终得到可溶性蛋白,产物经SDS-PAGE分析表明,在44 ku处有一明显条带,与预期蛋白分子量一致,蛋白纯度约为80%,采用Somogyi法测得GTFB/CAT蛋白的比酶活为1.66 IU/mg。研究表明:成功克隆GTFB/CAT基因并通过在E.coil BL21原核体系中表达得到有生物活性的可溶性蛋白,为后续研究GTF的抗结剂及预防龋齿的效果及机理奠定了基础。     

重组干扰素-tau在大肠杆菌中的高效表达

目的研究重组干扰素-tau的纯化和复性。方法将构建好的重组质粒pBV220转化E.coli BL21,发酵培养后迅速升温至42℃诱导干扰素-tau以包涵体的形式高效表达。裂菌后利用8mol/L尿素溶解目的蛋白质,经凝胶过滤色谱层析纯化后,再透析复性。结果干扰素-tau的表达量占菌体总蛋白质量的20%以上,纯化后纯度可达9 6%以上,活性得到有效恢复。结论建立了干扰素-tau纯化及复性的方法,获得了高表达、高纯度、有活性的干扰素-tau。     

重组人SOD2/3杂合酶原核表达及纯化方法的研究

目的 摸索工程菌的表达条件并分离纯化,获得高活性的重组人SOD2/3杂合酶(rhSOD2/3).方法 利用含有质粒pET-28a-SOD2/3的工程菌诱导表达rhSOD2/3,考察诱导温度、诱导剂浓度、Mn2+浓度与加入时机对重组酶表达量与活性的影响;利用金属螯合亲和层析纯化rhSOD2/3.结果 重组酶的表达量占菌体...     

西维因单链抗体基因克隆、表达及活性分析

利用兼并引物从西维因单克隆杂交瘤细胞的cDNA中克隆得到抗体基因的轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）,长度分别为324bp和360bp,将其分别连接入pGEM-T-Easy载体进行测序;根据测序结果设计特异性引物和连接序列（Gly4Ser）3,利用重叠延伸PCR扩增得到长度为729bp的单链抗体基因片段（scFv）,亚克隆至原核表达载体pET30a（+）,并转化感受态细胞BL21（DE3）进行诱导表达;聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,重组表达单链抗体形成包涵体,分子量大小约为33kDa,变性后利用不同条件进行复性,结果显示最佳复性时间为48h,最佳起始蛋白浓度为200μg/mL,含有精氨酸的复性液效果最佳;利用亲和层析纯化scFv,并利用竞争ELISA检测其活性,结果显示该scFv对西维因具有良好的亲和性和特异性。      

Mincle受体蛋白克隆、原核表达与纯化

本研究通过应用基因工程技术,构建融合基因pET14b-Mincle的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白Mincle,并对其表达产物进行纯化、鉴定、透析复性。采用RT-PCR技术扩增小鼠Mincle的基因片段,将其克隆于载体pMD18-T中,并克隆到带有His-tag的原核表达载体pET14b中;重组质粒经酶切鉴定、序列比对验证正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达目的蛋白。经1mmol/LIPTG在37℃下诱导5h获得了分子量约为22kDa的重组融合蛋白的优化表达,SDS-PAGE、Western Blot和ELISA证实了重组蛋白的特异性。Mincle以包涵体形式在宿主中表达,利用Ni2+亲和柱进行纯化和生物膜透析复性,纯化和透析后的蛋白经WesternBlot、ELISA法定性鉴别以及用白色念珠菌(SC5314)整个灭活细胞对复性后蛋白的活性测定,透析后的Mincle重组融合蛋白能与白色念珠菌的特异性结合体现其生物活性,表明获得了具有活性的蛋白,为后续研究打下基础。     

植物乳杆菌DMDL 9010中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

研究了植物乳杆菌DMDL 9010亚硝酸盐还原酶基因克隆、表达及表达产物的纯化。首先以植物乳杆菌DMDL 9010的DNA为模板,利用PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,扩增后nir编码序列大小为1638 bp,再将其编码序列克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化到感受态细胞DH5α,成功构建重组质粒p ET-32a(+)-nir。将重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株E.coli BL21中,在IPTG浓度为1 mmol/L和诱导温度为25℃的条件下诱导4 h后诱导表达NIR蛋白,经诱导后的工程菌能将50μg/m L的亚硝酸盐降解90%以上,利用亲和层析柱Ni sepharose 6 Fast flow进行纯化得到重组蛋白,该重组蛋白经SDS-PAGE电泳后的分子量约为60 KDa。总之,经由植物乳杆菌DMDL 9010克隆出亚硝酸还原酶基因,并成功构建了重组质粒p ET-32a(+)-nir,利用基因工程方法得到的工程菌能有效降解亚硝酸盐,并能利用亲和层析得到高纯度的NIR。     

诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率影响的研究

目的研究诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率的影响,探讨包涵体质量评价体系。方法在不同时间诱导产生重组羧肽酶原B包涵体,研究其变性和复性、对蛋白酶K的稳定性及在一定浓度盐酸胍溶液中的化学变性,分析诱导时间与包涵体复性率的相关性。结果诱导时机不同,所得重组羧肽酶原B包涵体复性率及对蛋白酶K的稳定性不同,在一定浓度盐酸胍溶液中的溶解性也不同。复性率越高的包涵体越不易被蛋白酶K酶解,对化学变性剂的稳定性也高。结论诱导时机影响重组羧肽酶原B包涵体的质量及复性率。     

TAT-凋亡蛋白质制备与抗肿瘤活性研究

目的制备TAT-凋亡蛋白质并研究其抗肿瘤活性。方法将重组质粒pET-28b-TAT-vp3转入E.coliBL21(DE3)中表达其蛋白质,利用Ni-NTA亲和柱纯化目的蛋白质包涵体,纯化样品透析复性后研究其抗肿瘤活性。结果30℃时重组蛋白质包涵体表达量最高,尿素变性条件下用Ni-NTA亲和柱层析纯化包涵体,用500mmol/L咪唑溶液洗脱,从镍柱上解离的目标蛋白质纯度达到92%以上。MTT实验表明,纯化后蛋白质浓度10μg/mL时,HeLa细胞存活率降至42%(IC50=4.2μg/mL);动物实验表明,样品组抑瘤率可达到48.3%。结论大肠杆菌表达的TAT-凋亡蛋白质具有抗肿瘤效应。     

诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率影响的研究

目的 研究诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率的影响,探讨包涵体质量评价体系.方法 在不同时间诱导产生重组羧肽酶原B包涵体,研究其变性和复性、对蛋白酶K的稳定性及在一定浓度盐酸胍溶液中的化学变性,分析诱导时间与包涵体复性率的相关性.结果 诱导时机不同,所得重组羧肽酶原B包涵体复性率及对蛋白酶K的稳定性不同,在一定浓度盐酸胍溶液中的溶解性也不同.复性率越高的包涵体越不易被蛋白酶K酶解,对化学变性剂的稳定性也高.结论 诱导时机影响重组羧肽酶原B包涵体的质量及复性率.