裂殖壶菌胞内油脂尼罗红荧光染色快速检测方法的研究

为了建立快速检测裂殖壶菌胞内油脂的方法,探讨了尼罗红荧光染色法检测裂殖壶菌油脂含量的检测条件。通过考察裂殖壶菌重悬液中添加二甲基亚砜体积分数、尼罗红染液用量、染色温度、染色时间及细胞密度对荧光强度的影响,确立最优检测条件,进一步考察细胞油脂含量与荧光强度的关系,从而建立尼罗红荧光检测法的定量关系。结果表明,最优检测条件为:每毫升裂殖壶菌重悬液中二甲基亚砜体积分数和尼罗红染液用量分别为25%和15μL,染色温度50℃,染色时间15 min。在最优检测条件下,细胞密度不超过0.218×10~8个/m L范围内,菌液油脂含量(X)与荧光强度(Y)呈现良好的线性关系,其线性关系式为Y=798.55X-3.44,相关系数R2为0.996 4。因此,采用尼罗红荧光染色法可以快速检测裂殖壶菌的油脂含量。     

尼罗红荧光光谱法快速测定解脂耶氏酵母油脂含量的研究

为了建立快速简便检测解脂耶氏酵母油脂含量的方法,探讨了尼罗红-光谱法测定解脂耶氏酵母油脂含量的检测条件。通过研究解脂耶氏酵母最佳发射光波长、细胞密度、尼罗红染液用量、染色时间、不同助溶剂效能及最佳体积分数对荧光强度的影响,确定了最佳检测条件,得到细胞油脂含量与荧光强度的线性关系。解脂耶氏酵母在激发光560 nm、发射光650 nm处有最高荧光值,每毫升菌液加入质量分数为0.1 mg/m L的尼罗红染液20μL,加入体积分数为15%的异丙醇,黑暗染色5 min,在细胞OD600=0~1.3的范围内,菌液的油脂含量(X)与荧光值(Y)呈较好的线性关系,线性关系式为Y=6.3651X+10.097,R2=0.9902,灵敏度达0.0001 g。该方法能够准确地反映出解脂耶氏酵母胞内油脂含量。尼罗红-荧光法可成为一种快速检测解脂耶氏酵母胞内油脂含量的新方法。     

尼罗红染色荧光定量海洋微拟球藻胞内油脂含量

以海洋微拟球藻Nannochloropsis oceanica为受试对象,采用尼罗红染色荧光定量胞内油脂含量。采用单因素实验考察了激发波长、发射波长、二甲基亚砜体积分数、染色时间、尼罗红质量浓度对微藻胞内油脂荧光强度的影响,在此基础上,采用响应面实验进行染色荧光定量条件优化。结果表明,优化的微拟球藻胞内油脂尼罗红染色荧光定量最佳条件为二甲基亚砜体积分数25.6%、染色时间16 min、尼罗红质量浓度0.11 μg/mL、激发波长430 nm、发射波长685 nm。在最佳条件下,尼罗红染色微拟球藻胞内油脂荧光强度与油脂含量显著正相关（R2=0999 9）,说明通过尼罗红染色荧光法可快速表征微拟球藻胞内油脂含量。研究结果为后续微拟球藻资源高值化应用及高产油脂海洋微藻快速筛选和动态追踪微藻产油过程提供了依据。     

荧光光谱法检测微藻中油脂

研究了尼罗红染色荧光光谱法检测微藻中油脂含量的方法.探讨了染色时间、尼罗红质量浓度、二甲基亚砜体积分数、细胞密度对藻液细胞发射光谱的影响,得到最佳测定条件为:染色时间6min,尼罗红质量浓度0.8 μg/mL,二甲基亚砜体积分数20%,细胞密度(0.248～0.448)×10<'9>个/mL.该研究为规模化筛选高含油量藻株及跟踪产油微藻油脂积累过程奠定了基础.     

尼罗红-荧光光谱法测定亚心形扁藻油脂含量

尼罗红-荧光光谱法能够快速地对微藻细胞中的油脂含量进行检测,但是该方法对所测微藻物种具有一定依赖性,在分析不同微藻细胞油脂含量前需要对测试条件进行优化。优化后的亚心形扁藻油脂含量分析条件为:藻液800×g离心5 min去除培养基,用体积分数4%的二甲基亚砜(DMSO)水溶液重悬至OD750=0.3,尼罗红质量浓度0.8μg/m L,避光40℃水浴恒温10 min,激发波长520 nm。发现亚心形扁藻在培养的对数生长后期油脂开始积累,稳定期后期油脂含量趋于恒定,优化后的尼罗红-荧光光谱法能够准确地检测亚心形扁藻生长过程中的油脂含量变化。     

尼罗红-荧光光谱法测定布朗葡萄藻油脂含量的方法研究

布朗葡萄藻因胞外分泌物多、细胞壁厚、聚集生长等原因,不能用传统的尼罗红染色方法进行油脂含量测定。通过探索染色前处理和染色条件,优化了布朗葡萄藻的染色方法:藻液摇匀后超声波处理3 min(超声波参数为温度20℃、发射功率100 W、频率40 k Hz),3 000×g离心去除培养基,用体积分数8%的DMSO重悬细胞,调整悬液OD750到0.16,每1 m L样品加入10#L 120μg/m L的尼罗红丙酮溶液(尼罗红质量浓度1.2#g/m L),40℃水浴锅中染色10 min,荧光激发光波长520nm。改进的方法促进了尼罗红与布朗葡萄藻的结合,提高了测定的稳定性和准确度。     

基于尼罗红荧光染色的小球藻脂质快速检测方法研究

尼罗红荧光染色的脂质测定方法已经应用到一些种类的微藻当中,但在细胞壁较厚的一些绿藻中因不易染色而无法应用.选用了4株小球藻,对尼罗红荧光染色测定脂质的方法进行改进,采用20％二甲基亚砜溶液作为渗透剂,在35 ～ 40℃下对藻细胞进行前处理,加强尼罗红与胞内脂质的结合;藻细胞密度的OD540在0.8～1.1范围内,加入15 μL质量浓度为0.1 mg/mL的尼罗红丙酮溶液染色可以有效提高荧光发射强度.该方法能够较为准确地反映胞内脂质含量,可以作为自然界中广泛筛选富脂绿藻的快速检测方法.     

Box-Behnken响应面法优化裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化工艺条件的研究北大核心CSCD

为了优化裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化工艺条件,以DHA酯化率为指标,在单因素实验基础上采用Box-Behnken响应面实验设计,考察了无水乙醇用量、浓硫酸用量、反应温度和反应时间对裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化的影响。结果表明:针对0.5 g干菌粉,得到最优的胞内转乙酯化工艺条件为无水乙醇用量11.76 m L、浓硫酸用量0.41 m L、反应温度75.5℃、反应时间2.24 h,在此条件下DHA酯化率达到85.19%。     

Box-Behnken响应面法优化裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化工艺条件的研究

为了优化裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化工艺条件,以DHA酯化率为指标,在单因素实验基础上采用Box-Behnken响应面实验设计,考察了无水乙醇用量、浓硫酸用量、反应温度和反应时间对裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化的影响。结果表明:针对0.5 g干菌粉,得到最优的胞内转乙酯化工艺条件为无水乙醇用量11.76 m L、浓硫酸用量0.41 m L、反应温度75.5℃、反应时间2.24 h,在此条件下DHA酯化率达到85.19%。     

葡萄糖亚适量补加胁迫裂殖壶菌胞内类胡萝卜素积累

为探究裂殖壶菌积累类胡萝卜素的营养胁迫调控手段,考察了发酵中期(72 h起),不同葡萄糖补加质量浓度、酵母提取物补加质量浓度对裂殖壶菌生长、油脂合成和类胡萝卜素合成的影响。结果表明:仅补加较低质量浓度葡萄糖时,裂殖壶菌生物量和油脂产量虽较低,但胞内类胡萝卜素含量较高;在5 L发酵罐中、发酵中期,采用溶氧反馈控制葡萄糖流加策略,人为制造葡萄糖亚适量补加条件,在发酵98 h时胞内类胡萝卜素含量达到最大,为151.0μg/g,相比葡萄糖充足供应条件下的水平提高了4倍以上。综合发酵实验结果和裂殖壶菌代谢途径分析,可推测:油脂合成期葡萄糖亚适量补加可限制细胞生长、弱化裂殖壶菌胞内油脂合成途径,胁迫碳源流向类胡萝卜素合成途径,促进类胡萝卜素的大量积累。     

裂殖壶菌油脂水酶法提取工艺优化及其脂肪酸组成分析

采用水酶法对裂殖壶菌油脂的提取工艺进行研究,通过单因素和正交实验优化提取工艺条件,并对裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成进行分析。实验结果表明,水酶法提取裂殖壶菌油脂的最佳工艺条件:复合酶配比2∶8(纤维素酶∶中性蛋白酶,U∶U),液料比4 m L/g,加酶量2 500 U/g,酶解温度55℃,酶解时间4h;在此优化条件下,裂殖壶菌油脂提取率为82.47%。裂殖壶菌油脂脂肪酸以C14∶0、C16∶0、C22∶5n-6和C22∶6n-3为主,其脂肪酸组成简单,且C22∶6n-3质量分数高达32.65%,表明裂殖壶菌油脂具有很高的营养价值和功能性油脂的开发潜力,可作为C22∶6n-3的重要食药来源。     

氮、磷源浓度对裂殖壶菌生长及油脂积累的影响

裂殖壶菌是替代深海鱼油产业化生产二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)油脂的极具潜力的微生物。该研究采用1株裂殖壶菌DP-16发酵产油脂,以葡萄糖为碳源,以酵母浸粉和谷氨酸钠为氮源,以KH₂PO₄为磷源,探究了氮、磷源浓度对菌体生长、葡萄糖消耗和油脂积累的影响。结果显示,在正常氮、磷源浓度下培养菌体,0～24 h为细胞增殖期,24～84 h为油脂积累期,在84 h油脂产量和油脂含量分别达到14.1 g/L和33.5%,84～96 h进入油脂反耗期。改变氮、磷源浓度,低磷条件下72 h的油脂产量和油脂含量分别达到14.8 g/L和44.3%,比对照组分别提高了5.0%和32.2%,而高氮、低氮、高磷等条件均不利于裂殖壶菌产油脂。研究结果表明,氮、磷源浓度对裂殖壶菌细胞生长和油脂积累产生重要影响,油脂产量取决于菌体生物量和细胞内油脂含量的乘积,为提高油脂产量,需要在获得高细胞浓度(生物量)和达到高油脂含量之间找到一个合适的平衡,以确定适宜的氮、磷源浓度。该研究对促进裂殖壶菌发酵产DHA油脂具有重要参考意义。     

裂殖壶菌单细胞油脂的组分特性分析

为了获得完整的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)油脂组分信息,以其单细胞油脂组分为研究对象,对裂殖壶菌单细胞油脂进行深入研究.结果表明:裂殖壶菌单细胞油脂占细胞干重的63.32％;单细胞油脂由87.864％的中性脂和11.322％的极性脂组成;单细胞油脂中DHA含量为41.45％;单细胞油脂中胆固醇、角鲨烯和β-胡萝卜素含量分别为40.93、19.99 mg/g和34.91 μg/g.经气相色谱-质谱联用分析表明:单细胞油脂的不皂化物中含有胆固醇、麦角固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、环阿屯醇和角鲨烯.     

不同碳氮源浓度和培养温度对裂殖壶菌产DHA的影响

研究不同碳氮源浓度和培养温度对裂殖壶菌产DHA的影响。用干重法测定裂殖壶菌的生物量,溶剂法提取油脂,并用GC分析DHA含量。结果表明:最适初始葡萄糖质量浓度和氮源质量浓度分别为80、15 g/L;菌种在26℃下培养48 h后,再将发酵温度降到22℃下培养120 h,其DHA含量为43.62%,DHA产量为5.23 g/L。在最佳条件下,50 L放大培养(先26℃培养48 h,后22℃培养96 h)后油脂产量可达14.8 g/L,DHA产量可达6.5 g/L。综上所述,裂殖壶菌具有较好的工业化生产潜力。     

裂殖壶菌粉的复合酶酶解破壁工艺研究

裂殖壶菌是一种富含DHA的海洋真菌,由于其细胞壁结构紧密,对其进行破壁是DHA提取工业化生产的重点工序.研究在适当条件下,应用复合酶对裂殖壶菌粉进行酶解破壁并提取其胞内油脂的工艺很有意义,实验分别探讨了破壁温度、pH值、酶用量、破壁时间等因素对油脂提取率及质量的影响,确定了复合酶破壁提取胞内油脂的较佳条件为:复合酶用量为0.263±0.012％,pH=7.45±0.5、破壁时间3.0hr,温度50±1℃.在此条件下进行试验,可获得含DHA粗油得率为83.85±0.8％.具有相应的工业应用前景参考.     

同步荧光法测定红葡萄酒中白藜芦醇含量

建立了一种应用同步荧光检测红葡萄酒中白藜芦醇的新方法,系统研究了检测条件对白藜芦醇荧光强度的影响。该方法的回归方程为Int(荧光强度)=19.70×Conc(浓度μg/mL)+13.98,相关系数r=0.9987。白藜芦醇产生的荧光强度与浓度在0～1.96×10-5mol/L的范围内具有良好的线性关系,检测限为8.14×10-10mol/L。     

利用酒糟处理液作为氮源培养裂殖壶菌生产DHA的发酵工艺优化

为降低发酵培养裂殖壶菌生产DHA的成本,以酱香型白酒酒糟为实验材料,将其简单预处理后作为裂殖壶菌发酵培养基氮源,首先分析了酒糟处理液与胰蛋白胨的游离氨基酸组成与含量,然后以生物量、油脂产量和DHA产量为指标,对酒糟处理液、胰蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏作为氮源培养裂殖壶菌生产DHA进行了比较,优化了酒糟处理液作为氮源时的发酵工艺条件,并对发酵废液进行三次循环利用。结果表明：酒糟处理液可以作为满足裂殖壶菌生长的氮源;与酵母提取物、牛肉膏相比,酒糟处理液作为氮源有明显优势;利用酒糟处理液作为氮源的最佳发酵工艺条件为酒糟（含水量约10%）与水质量比1∶ 9、酒糟处理液添加量70%（与基础发酵培养基中水的置换比例）、初始pH 7.0、培养时间108 h,在此条件下裂殖壶菌生物量、油脂产量和DHA产量分别达到22.14、8.88 g/L和284 g/L;最佳条件下三次循环添加15.0%（与基础发酵培养基中水的置换比例）发酵废液于酒糟处理液培养基中,裂殖壶菌DHA产量分别为4.27、3.70 g/L和2.75 g/L。综上,利用酒糟处理液培养裂殖壶菌生产DHA是酒糟资源化利用的新方法。     

利用酒糟处理液作为氮源培养裂殖壶菌生产DHA的发酵工艺优化

为降低发酵培养裂殖壶菌生产DHA的成本，以酱香型白酒酒糟为实验材料，将其简单预处理后作为裂殖壶菌发酵培养基氮源，首先分析了酒糟处理液与胰蛋白胨的游离氨基酸组成与含量，然后以生物量、油脂产量和DHA产量为指标，对酒糟处理液、胰蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏作为氮源培养裂殖壶菌生产DHA进行了比较，优化了酒糟处理液作为氮源时的发酵工艺条件，并对发酵废液进行三次循环利用。结果表明：酒糟处理液可以作为满足裂殖壶菌生长的氮源；与酵母提取物、牛肉膏相比，酒糟处理液作为氮源有明显优势；利用酒糟处理液作为氮源的最佳发酵工艺条件为酒糟(含水量约10%)与水质量比1∶9、酒糟处理液添加量70%(与基础发酵培养基中水的置换比例)、初始pH 7.0、培养时间108 h,在此条件下裂殖壶菌生物量、油脂产量和DHA产量分别达到22.14、8.88 g/L和2.84 g/L;最佳条件下三次循环添加15.0%(与基础发酵培养基中水的置换比例)发酵废液于酒糟处理液培养基中，裂殖壶菌DHA产量分别为4.27、3.70 g/L和2.75 g/L。综上，利用酒糟处理液培养裂殖壶菌生产DHA是酒糟资源化利用的新方法。     

同步荧光法分析红葡萄酒中微量白藜芦醇含量的研究

建立了一种应用同步荧光检测红葡萄酒中白藜芦醇的新方法,系统研究了检测条件对白藜芦醇荧光强度的影响。该方法的回归方程为Int(荧光强度)=19.70×Conc(浓度μg/mL)+13.98,相关系数r2=0.9987。白藜芦醇产生的荧光强度与浓度在0mol/L～1.96×10-5mol/L的范围内具有良好的线性关系,检测限为8.14×10-10mol/L。     

亚铁离子和吲哚丁酸促进裂殖壶菌产DHA及发酵验证

为提高裂殖壶菌产DHA的生产强度,筛选比较出对裂殖壶菌生长和产油有显著影响的促进因子,发现Fe~(2+)对Schizochytruim sp.AB-610生长有显著的促进作用,吲哚丁酸(IBA)对裂殖壶菌生长和产油有双重促进作用。在此基础上进行了两因素(Fe~(2+)和IBA)、三水平响应面实验,通过响应模型得到最优添加方案。在摇瓶发酵中得到验证后,继而在NBS 7.5 L发酵罐内测定对照组Schizochytruim sp.AB-610的发酵特性曲线,依据其发酵规律,将发酵周期分为菌体适应期、快速生长期、油脂快速积累期、油脂返耗期。测定了Fe~(2+)和IBA对7.5 L发酵罐中裂殖壶菌培养和发酵的特征曲线,并与对照组进行多参数比对,发现添加双促进因子可加大快速生长期的细胞生长速率,延长生物量增长的时间,生物量和DHA产量皆得到提高。最终使Schizochytruim sp.的DHA生产强度提高了51.22%。