不产桔霉素高产红曲色素的基因工程红曲菌株构建

以一株高产红曲色素的紫色红曲菌（Monascus purpureus）J01为研究对象,采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导 的T-DNA转化技术,敲除紫色红曲菌株J01基因组中的桔霉素合成关键基因pksCT,构建一株不产桔霉素高产红曲色素的红曲菌株。 结果表明,通过菌落形态观察和生物量测定得出,菌株J42与菌株J01的菌落形态及生物量无显著性差异（P＞0.05）;经高效液相色谱（HPLC）与液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析得出,菌株J01的桔霉素含量为5.1mg/kg,pksCT基因敲除菌株J42菌丝体中未检测到 桔霉素;菌株J42的黄色素,橙色素和红色素色价分别为1 877 U/g、773 U/g、1 068 U/g,显著高于菌株J01（P＜0.01）,并且菌株J42的红 曲色素总色价为415 U/mL,是原始菌株的1.56倍,成功构建了一株不产桔霉素高产红曲色素的生产菌株J42。     

两种红曲菌固态发酵产莫纳可林K和桔霉素的比较

红曲菌可产生具有降血脂功能的莫纳可林K,但部分菌株产生的桔霉素引起了人们对红曲产品安全性的担忧。选取11株紫色红曲菌和10株红色红曲菌,通过高效液相色谱法分析各菌株固态发酵所产红曲米中莫纳可林K和桔霉素的含量。结果表明,11株紫色红曲菌和4株红色红曲菌可产生桔霉素,1株紫色红曲菌和9株红色红曲菌可产生莫纳可林K。其中5株红色红曲菌所生产的红曲中莫纳可林K和桔霉素含量符合QB/T 2847—2007《功能性红曲(米粉)》。该结果可为修改红曲产品相关标准提供有价值的信息。     

高产色素红曲菌的选育及摇瓶发酵培养基优化

红曲菌发酵生产食用色素被认为是微生物发酵法生产天然色素行业中最成功的范例之一,如何提高红曲菌发酵生产色素的水平吸引了越来越多的关注。本实验以紫色红曲菌(Monascus purpureus)H1102为出发菌株,在优化原生质体制备条件的前提下,对红曲菌采用原生质体紫外诱变,获得了一系列菌体形态、色素产量发生变化的突变株。经高渗平板初筛,液态摇瓶发酵复筛一系列实验获得了一株高产色素,且桔霉素含量仅0.62 mg/L的紫色红曲菌H1102-5,并对发酵培养基做了优化实验,优化后的摇瓶实验发酵液色价可达514U/mL,相对于出发菌株提高了121%,为红曲色素的大规模发酵生产奠定了基础。     

8株红曲菌生产特性研究

采用固态和液态两种发酵方法对8株野生红曲菌进行发酵,分析对比其产色素能力、产生理活性物质莫纳可林(Monacolin K)能力及产桔霉素情况,以筛选出可在发酵食品工业上安全应用的优良红曲菌菌株。结果表明:8株红曲菌生产特性存在显著性差异,其中L2菌株红曲色素产量和Monacolin K产量最高,而真菌毒素桔霉素产量最低,是一株可安全应用于发酵食品工业的优良菌株。     

氯化铵对紫色红曲霉固态发酵红曲色素和桔霉素合成的双向调控作用

研究了氯化铵对紫色红曲霉M3103次级代谢产物中红曲色素和桔霉素合成代谢的影响及其调控机制。结果表明:在以红米为固态发酵基质的培养基中外加氯化铵能显著提高红曲色素产量,降低桔霉素产量;通过高效液相色谱-紫外可见光全波长扫描分析红曲色素组成,发现添加氯化铵显著提高了红曲黄色素和橙色素的产量;通过实时荧光定量PCR检测,红曲色素合成关键基因mppC、mppD、mppE、MpFasA2和MpPKS5的表达量与空白组相比均显著上调,而桔霉素合成关键基因ctnA和PksCT的表达量与空白组相比均显著下调。固态发酵中添加适量的氯化铵可影响紫色红曲霉M3103对营养物质吸收和代谢,有利于促进红曲色素尤其是黄色素的生物合成,抑制桔霉素的合成。     

红曲霉菌株固态发酵特性的比较研究

以籼米为固态培养基分别对8株红曲菌的发酵特性进行研究,比较其产糖化酶、产色素以及产桔霉素的能力,筛选出可应用于红曲黄酒酿造的优良红曲霉菌株。结果表明不同红曲菌的菌株特性存在显著性差异,成曲中橙色红曲菌(M.aurantiacus)B5菌株具有最低的产桔霉素能力,较高的产色素和产糖化酶能力,其桔霉素产量9.06μg/g,醇溶性总色价420.82 U/g,水溶性总色价117.6 U/g,产糖化酶酶活力410.7 U/g。B5菌株是可应用于红曲黄酒酿造的优良红曲菌。跟踪菌株B5在制曲过程中代谢产糖化酶、色素及桔霉素能力的变化情况,综合各个指标的变化趋势得出制曲最佳时间为9 d。     

酿酒用高产洛伐他汀红曲菌的筛选

为获得酿酒用高产洛伐他汀红曲菌株,研究以洛伐他汀含量、红曲色素色价、桔霉素含量及红曲菌产酶能力为评价指标,通过固态发酵法从不同产地40份红曲米中筛选出1株高产洛伐他汀的菌株H5-3,经形态观察和分子生物学鉴定,判定该菌株为紫色红曲菌。经过检测,菌株H5-3的洛伐他汀产量高达17.90mg/g,红色素色价3195.27μ/g,糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶的活力分别达2514.26、0.32、300.19U/g,且该菌株不产桔霉素,是可应用于红曲黄酒酿造的功能红曲菌。进一步将该紫色红曲菌H5-3应用于红曲黄酒的酿造,制得的红曲黄酒中洛伐他汀质量浓度63.75mg/L,红色素色价22.86μ/mL,酒精度14.86%,总酸4.90g/L,氨基酸态氮0.83g/L。对制得的红曲黄酒风味物质进行分析,发现有机酸质量浓度为12.70g/L,其中乳酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸为其主要成分,分别占总量质量分数的28.2%、21.9%、14.5%、12.2%、5.7%；游离氨基酸质量浓度3540.58mg/L；在挥发性风味物质中,酯类、醇类为主要成分,分别占总量质量分数的48.4%、43.9%,其中乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、正丙醇、苯乙醇等含量较高,对风味有较大贡献；有机酸、游离氨基酸和挥发性风味物质含量比例协调。希望研究对传统红曲菌种资源的发掘利用以及红曲黄酒保健功能的提升具有参考价值。     

4株红曲霉发酵产生次级代谢产物的分析

目的为研究评价红曲霉产生次级代谢产物能力,选育优良菌株。方法通过建立的发酵液中γ-氨基丁酸(GABA)、红曲色素、monacolin K和桔霉素的比色法和高压液相色谱检测方法,比较了紫色红曲霉(Monascus purpureus)、丛毛红曲霉(Monascus pilosus)、红色红曲霉(Monascus ruber)、橙色红曲霉(Monascus aurantiacus)的液体发酵产生上述次级代谢产物能力。结果不同红曲霉菌株产生上述4种次级代谢产物的能力是不同的,4种红曲霉均可产生的红曲色素、monacolin K和桔霉素3种次级代谢产物,其中M.pilosus J2的monacolin K产量最高(8.1 mg/L)、桔霉素生成量最低(0.09 mg/L);M.purpureus Y4的红曲色素色价最高,为380U/mL;仅有紫色红曲霉Y4可代谢产生γ-氨基丁酸,产量约为0.2 g/L。结论不同红曲霉菌株产生γ-氨基丁酸、红曲色素、monacolin K和桔霉素这4种次级代谢产物能力存在较大差异。     

福建红曲中高产色素红曲菌的筛选及其诱变育种研究

福建省是中国盛产红曲的省份之一,其红曲品种多样。采用选择性培养基分离纯化福建各地区红曲米中的红曲菌,得到13株红曲菌纯菌株,分别命名M-1~M-13。通过液态发酵和固态发酵相结合筛选得到1株高产色素的红曲菌M-3。经菌落形态特征观察、生理生化试验以及分子生物学鉴定手段,鉴定红曲菌M-3为高粱红曲菌(M.kaoliang)。通过工厂化固态发酵试验该菌株的色素产量高达5523U/g,出曲率为44%。采用物理化学复合诱变(紫外诱变和氯化锂诱变)的方法对出发菌株M-3进行了诱变选育,筛选得到1株色素高产突变菌M-3-7,且连续传接6代色素产量稳定,三角瓶固态发酵色价保持在9500U/g左右。将其应用于工厂化固态发酵,结果表明色素高产突变菌M-3-7的色素产量高达6400U/g,比原菌高出15.9%,高于国内外报道的其他色素高产菌株的固态发酵生产水平。研究结果为我国红曲菌资源的整合以及红曲色素的工厂化大规模发酵生产奠定了前期基础。     

三种红曲菌固态发酵产桔霉素及桔霉素生物合成相关基因的比较

采用高效液相色谱-荧光检测法测定了3种22株红曲菌所产红曲中的桔霉素含量,并用2对引物通过PCR和测序的方法检测了这22株红曲菌的桔霉素生物合成相关基因pksCT和ctnA的分布情况,探讨了两者的相关性,旨在为筛选低产甚至不产桔霉素的红曲菌菌株提供信息。研究表明,11株紫色红曲菌和4株红色红曲菌可产生桔霉素,pksCT和ctnA扩增阳性; 6株红色红曲菌未检出桔霉素,pksCT扩增阳性,但ctnA扩增阴性; 1株血红红曲菌的pksCT在扩增的编码区有1个单碱基缺失,且ctnA扩增阴性,未检出桔霉素。结果表明,基因组中同时存在有功能的pksCT和ctnA基因与3种红曲菌的固态发酵产物桔霉素检测阳性结果相关。     

微生物絮凝剂产生菌的筛选

以菌株发酵液对高岭土悬浊液的絮凝效果为指标,从活性污泥等样品中筛选获得53株具有絮凝活性的菌株。经进一步摇瓶复筛获得一株摇瓶发酵液絮凝率达71.8%的菌株2-21。依据菌落形态、菌体形态及部分生理生化特征研究,初步鉴定菌株2-21可能为肠杆菌属（Enterobacter）。结合蛋白质定性检测及糖类物质的呈色反应初步推断该菌株所产絮凝剂的主要成分为糖蛋白。     

纤维素酶高产菌株的选育

该文通过利用紫外线、亚硝基胍等对里氏木霉进行诱变处理 ,采用低剂量、反复多次复合诱变处理方法 ,用“以 2 -脱氧葡萄糖作为降解产物阻遏物”的高效筛选方法 ,选育得到一株抗分解代谢阻遏的突变株 ,使纤维素酶活力提高了三倍     

产生淀粉酶系菌株的筛选及其混株发酵粗酶研究

从6株霉菌中筛选出具有较强生淀粉分解能力的黑曲霉、米曲霉、宇佐美曲霉和少根根霉,并进行混株发酵,试验结果表明,所得粗酶分解生淀粉能力显著提高。最低的D组提高5．43％,最高的E组提高10．0％,而且菌株的种属会明显影响分解生淀粉的能力。     

腐乳生产菌种的选育

从毛霉ＭｕｃｏｒＺ３ｌ８出发，选育出Ｍ．Ｚ３２８变异株。研究了Ｍ．Ｚ３２８变异株的前酵条件：Ｔ＝３０±１℃，相对湿度９５％．采用新工艺进行生产实验，前酵时间仅需２２ｈ．首次发现毛霉菌丝能渗透到豆腐坯的最深层。用正交试验确定后酵条件。优化结果表明，采用低盐控温后酵新工艺，能将后酵时间缩短到１０～１２ｄ，即可生产出氨基酸态氮高达１．７５ｇ／１００ｇ干腐乳以上的白腐乳。其质构、颜色等均能达到质量要求。研究了腐乳发酵过程的流变特性，微细结构及ＤＳＣ．图谱的变化情况。     

高产木聚糖酶菌株的筛选

本课题成功地从自然界分离筛选出了X（y-1）、X（y-5）两株高产木聚糖酶菌株，并利用玉米芯为原料制备了木聚糖，对木聚糖的制备殁酶解条件进行了探讨。结果表明：木聚糖最佳的酶解条件为pH5．0、温度50℃，酶解时间18h；用10％NaOH85℃下恒温浸提4h，木聚糖的提取率最高。     

纤维素酶高产菌株选育研究进展

本文综述了纤维素酶的类别及产纤维素酶的微生物菌种,不同菌株通过各种方法诱变选育,可提高产纤维素酶的能力,旨在为更好地利用产纤维素酶高的菌株提供参考。     

富硒酵母菌株的选育

以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae L-11为出发菌株,通过DES多次诱变,Na2SeO3和乙硫氨酸抗性平板选择,得到一株高硒和高蛋氨酸含量的菌株L-11-7-2,其蛋氨酸含量达到1.37%,是L-11的169%.对L-11-7-2进行富硒培养,细胞内总硒和硒蛋氨酸分别为2452μg/g和1650μg/g,分别为出发株的280.2%和369.1%.     

土壤中正己醇降解菌的多样性研究

目的：筛选能够有效降低正己醇含量的微生物菌种,了解自然界中正己醇降解菌的分布与多样性。方法：以正己醇生产厂废水排放口周围的土壤为分离源,通过富集培养和分离筛选。结果：获得了6 株对正己醇有显著降解作用的菌种,根据其在PDA 培养基上的菌落形态和孢子形态初步分类鉴定为镰孢菌属、地霉属、毛霉属和曲霉属。其中,地霉属的菌株最多(3 株),对正己醇的降解能力强,适用pH 值范围广。地霉属菌株S12 和S13在中性和酸性条件下对3g/L 正己醇的降解率均达60% 以上。结论：自然界中的正己醇降解菌在种类、生态、降解能力、作用条件等方面都具有丰富的多样性。     

产赤藓糖醇菌株的筛选与鉴定

利用含有300g/L 葡萄糖的高渗培养基从蜂蜜、花粉、土壤等样品中筛选耐高渗酵母菌,经薄层层析和高效液相色谱分析得到两株产赤藓糖醇且不产甘油的酵母菌,通过高碘酸氧化法筛选出其中赤藓糖醇产量较高的一株菌株E54。菌株E54 在含葡萄糖200g/L、酵母膏5g/L 的发酵培养基中发酵90h,赤藓糖醇产量为41.1g/L,转化率为22.8%。通过形态观察、生理生化实验、5.8S rDNA 序列分析并构建系统进化树,初步鉴定E54 为Moniliellaacetoabutans(丛梗孢酵母)。     

细菌纤维素高产菌株的筛选及鉴定

以残次的水果为原料,经静置富集培养、多次筛选纯化等步骤,分离出一株细菌纤维素产量较高且遗传性能稳定的菌株G-29。根据第二版《伯杰系统细菌学手册》和第九版《伯杰氏细菌鉴定手册》,对该菌株进行形态、生理生化特征和16S rDNA 分子序列分析。初步鉴定该菌为葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)一个新菌种或者中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius)的一个亚种。菌株G-29 已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M208234。