脱氧雪腐镰刀菌烯醇酶联免疫检测方法的建立

应用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体12D1建立了竞争间接ELISA方法,用于检测小麦、玉米中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),最低检出限为20ng/mL,检测范围为20￣460ng/mL。用蒸馏水提取掺合DON(250￣4000ng/g)的小麦样品,回收率为82.1%￣96.6%,变异系数为0.6%￣7.1%。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化产物的培养提取及制备

以禾谷镰刀菌Fusarium graminearum大型分生孢子定量接种大米培养物,制备毒素粗提液,采用硅胶柱一步洗脱分离、分段收集可同时获得脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）和乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇（acetyldeoxynivalenol,AcDON）,采用一步结晶法即可分别制备获得毒素纯品,并经红外光谱法、液相色谱-质谱联用技术及核磁共振氢谱等分析确证,液相色谱分析表明两种毒素纯度均大于98%。该培养提取及分离制备方法改变了常规多步骤繁琐过程,提供了一种切实有效的、大量制备纯化DON及乙酰化DON毒素的简便方法。     

粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇提取方法的验证与优化

根据脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)溶于水的性质,用水提取DON,经免疫亲和柱净化后,用高效液相色谱-紫外检测器测定,外标法定量.试验结果表明,验证后DON的回收率高达85％～90％,符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》规定要求.     

高效液相色谱法测定粮食中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇

本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A快速测定粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法。玉米样品经磨碎后用水匀浆提取,提取液经过免疫亲和柱净化,超高效液相色谱LC-30A紫外检测器检测。试验结果表明：线性范围0.05~10.00μg/mL,相关系数大于0.999 9;标准样品的仪器检出限为0.016μg/mL,仪器定量限为0.05μg/mL;3个浓度标样的保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.041%~0.043%和0.11%~1.57%之间;玉米样品3个浓度加标回收率在81.2%~90.0%之间。该方法简便快速,且易操作。     

小麦籽粒中原型及修饰型脱氧雪腐镰刀菌烯醇的产生规律研究

目的研究原型脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)及其修饰型的产生规律。方法以小麦籽粒为培养材料,辐照灭菌后接种禾谷镰刀菌,并分别在不同温度(10、20、30℃)和水活度(0.95、0.98 a_w)下培养不同时间(7、14、21、28、35d)后,运用超高效液相色谱-串联质谱检测DON,3-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyl-deoxynivalenol,3-ADON),15-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyl-deoxynivalenol,15-ADON)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(deoxynivalenol-3-glucoside,D3G)的产量。结果在所有培养条件下,原型DON的产量均随时间延长而增加;并于0.98 a_w, 20℃下的第35 d达到最高值100490.0μg/kg;不同培养条件下,修饰型DON的生成情况各不相同,3-ADON、15-ADON和D3G分别于0.98a_w,20℃下的第14、28和35 d达到各自产量最高值(3-ADON:7583.5μg/kg; 15-ADON:592.0μg/kg; D3G:6806.4μg/kg)。此外, 10℃下,D3G/DON比值随时间延长先增高后降低,而20、30℃下D3G/DON比值随时间延长呈指数下降(r~20.90)。结论小麦籽粒中原型和修饰型DON的最适产生条件均为0.98 a_w, 20℃。本研究可为DON及其修饰型的生物合成、日常监管、污染防控等提供理论基础和科学依据。     

2020年我国粮食及其产品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素污染情况与分布特征

摘要：目的 本研究旨在了解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)毒素在各种粮食和在全国各地区的污染情况及分布规律。方法 将粮食样品充分研磨,采用ELISA酶联免疫吸附测定法进行检测,在包被了DON毒素的微孔中加入标本,标准品和抗体。温育并洗涤之后,用酶标仪测定吸光度,计算样品浓度。 结果 在不同种类的粮食中,玉米中DON毒素含量与大米、绿豆、红豆相比差异有意义(p＜0.05)。玉米不同加工产品中的毒素含量玉米面与玉米渣,玉米与玉米渣之间有显著性差异(p＜0.01)。玉米DON毒素含量西北与北方,西北与南方比较差别有意义(p＜0.05);面粉DON含量北方与南方比较差别有意义(p＜0.05);大米中DON含量西北与南方,北方与南方比较差别有显著性意义(p＜0.01)。 结论 不同粮食毒素的含量不同,玉米中的毒素含量较高。玉米不同加工方式生产的产品毒素的含量有所不同。粮食中DON毒素含量的分布情况与环境气候有较大关系。     

粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇风险预警研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇是小麦和玉米等粮食中常见的真菌毒素,受污染的粮食会严重影响人和动物健康,控制粮食产前镰刀菌感染和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的积累是保障粮油食品安全的重要环节。当前,世界各国都十分重视粮食真菌毒素污染风险预警工作,粮食产前脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染预警研究近年来发展迅速,在脱氧雪腐镰刀菌烯醇积累的田间影响因素研究和建立产前风险预警模型中,都取得了一定进展。本文综述了脱氧雪腐镰刀菌烯醇风险预警的最新研究成果,旨在总结和整合现有的研究方法和成果,为开展我国粮食真菌毒素早期预警提供参考。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇ELISA定量检测试剂盒的研制*

研制了脱氧雪腐镰刀菌烯醇ELISA试剂盒,用于检测谷物粮食中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxyni-valenol,DON).在抗DON单克隆抗体的基础上,用间接竞争酶联免疫吸附检测试剂盒各项指标.结果为:试剂盒最低检测浓度为20 ng/mL,检测线性范围为50～400 ng/mL,IC<,50> 103 ng/mL.平均加标回收率>80%,批内变异系数小于10%,批间变异系数<15%.用试剂盒测定盲样,其结果与德国拜发试剂盒及免疫亲和柱-高效液相色谱检测结果无显著性差异.说明试剂盒指标符合相关技术要求,具有快速、灵敏、准确、方便等特点.     

粮食中主要真菌毒素危害及联合毒性研究进展

真菌毒素由丝状真菌代谢产生,具有很强的毒性。基于人类肝癌细胞系（HepG2细胞）能形成稳定的细胞系,分泌多种血浆蛋白,可以有效评估真菌毒素的体外毒性。文章综述了主要真菌毒素对粮食的危害,以及真菌毒素间联合毒性对人体细胞产生的副作用,对未来预测和预防粮食中真菌毒素对人体和动物健康影响意义重大。     

小麦和玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇与雪腐镰刀菌烯醇的免疫亲和净化-高效液相色谱检测方法研究

目的建立小麦和玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇与雪腐镰刀菌烯醇的免疫亲和净化-高效液相色谱检测方法。方法样品经纯水提取后,用免疫亲和柱净化,经甲醇洗脱,在C18色谱柱上等度洗脱分离,采用紫外检测器检测。结果标准曲线在0.1~2.0 mg/kg范围内线性良好。小麦基质中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的回收率为72.8%~110.1%,精密度为3.6%~10.8%,实验室内Hor Rat值为0.24~0.48;玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的回收率为72.2%~90.6%,精密度为1.2%~5.2%,实验室内Hor Rat值为0.07~0.31。小麦基质中雪腐镰刀菌烯醇的回收率为58.9%~100.4%,精密度为3.6%~11.3%,实验室内Hor Rat值为0.23~0.63;玉米中雪腐镰刀菌烯醇的回收率为56.9%~91.9%,精密度为2.5%~7.8%,实验室内Hor Rat值为0.11~0.43。结论该方法具有灵敏度高、重现性好、操作简便、准确可靠等特点,适用于小麦和玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇与雪腐镰刀菌烯醇的测定。     

鲜榨果汁基因组DNA快速提取方法的建立及优化

目的 建立及优化鲜榨果汁基因组DNA快速提取方法。方法 本研究比较了植物 DNA 快速提取试剂盒法、棉签法、纤维素膜片法和滤纸片法 4 种方法提取 15 种鲜榨果汁基因组 DNA 的效果,并筛选不同的提取液和裂解液、优化裂解液中的盐酸胍浓度和果汁基因组提取时间。结果 滤纸片法采用DNA裂解液（6 mol/L盐酸胍、1%聚乙烯吡咯烷酮、50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、20 mmol/L乙二胺四乙酸、21.3 mmol/L曲拉通-X-100;pH 6.4）、DNA漂洗液1（8 mol/L盐酸胍、50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐;pH 6.4）和DNA漂洗液2（10 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100 mmol/L氯化钠;pH 8）即可在 5 min 内从鲜榨果汁中提取得到适用于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的基因组 DNA。结论 本研究建立的滤纸片法不需要离心机等昂贵的仪器设备、操作简单、无刺激性气味、无环境条件限制,具有快速、价廉、环保等优点,为果汁基因组 DNA 快速提取与现场鉴定研究提供了参考。     

改良十六烷基三甲基溴化铵-磁珠核酸提取方法及在植物转基因检测中的应用

目的 建立一种快速、高效、便捷的植物基因组DNA提取方法并运用于植物转基因检测。方法 改良传统的十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium ammonium bromide, CTAB)方法, 并结合磁珠吸附基因组DNA, 配合核酸自动提取系统提取水稻和加工米粉中的核酸, 荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测Bt63大米转基因成分, 并与另外4种提取方法的结果进行对比, 评价提取效果。结果 5种不同方法中CTAB-磁珠法提取的样品基因组DNA浓度和质量最佳, 荧光PCR检测低浓度Bt63转基因成分(0.01%)的Ct值最小, 检测结果最好。结论 该方法可高效快速地提取植物核酸, 在低含量的转基因成分检测中相比其他几种方法具有绝对优势。     

绍兴黄酒酒曲总DNA的提取及其真菌多样性

目的:对于黄酒酒曲样品,选择一种合适的总DNA提取方法,并对其中真菌群落结构进行多样性分析。方法:因其质地,结合以往DNA提取方法,比较分析不同方法所获得的总DNA纯度、得率及凝胶电泳图,对实验结果较好的DNA样本进行真菌引物PCR扩增后纯化定量,再经Miseq高通量测序后进行生物信息分析。结果:实验结果表明,使用试剂盒+物理化学酶法获得了较高质量的样品总DNA,A₂₆₀/A₂₈₀比值也接近理想水平,PCR扩增后凝胶电泳图能够得到目的条带,OTU分类、Shannon曲线和系统进化树图显示了其真菌多样性。结论:通过数据的比较和分析,确立了选择的方法是一种较理想的酒曲总DNA的提取方法,对其真菌群落的测定及分析,也为后期开拓黄酒微生物资源提供了有力工具。      

Technical note: Improved method for rapid DNA extraction of mastitis pathogens directly from milk

Efficient control against bovine mastitis requires sensitive, rapid, and specific tests to detect and identify the main bacteria that cause heavy losses to the dairy industry. Molecular detection of pathogenic microorganisms is based on DNA amplification of the target pathogen. Therefore, efficient extraction of DNA from pathogenic bacteria is a major step. In this study, we aimed to develop a specific, sensitive, and rapid method to extract DNA directly from the main gram-positive bacteria known to cause bovine mastitis (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, and Streptococcus uberis) found in milk samples. The DNA extraction method is based on the lysing and nuclease-inactivating properties of the chaotropic agent, guanidinium thiocyanate, together with the nucleic acid-binding properties of the silica particles. An efficient protocol consisting of 6 basic steps (3 of which were done twice) was developed and applied directly to milk samples. Absence of PCR inhibitors and DNA quality were evaluated by PCR amplification of the species-specific DNA sequences of the target bacteria. The level of sensitivity achieved in our experiments is applicable to milk sample analysis without sample enrichment.     

食源性致病菌DNA快速释放提取试剂的研制

目的 研制一种食源性致病菌DNA快速释放提取试剂并优化其使用方法。方法 采用正交试验法,以qPCR扩增Ct值为指标,考察曲拉通X-100(Triton X-100,A)、十二烷基硫酸钠（SDS, B）、乙二胺四乙酸（EDTA, C）和乙基苯基聚乙二醇（NP-40, D）四因素对释放效果的影响,并用实际样品加标后检测判定样品基质对释放效果的影响,对适用过程进行进一步优化。结果最优试剂组合为A1B2C2D2,即Triton X-100的浓度为5.5%、SDS为0.04%,EDTA为2 mmol/L,NP-40为2%时,提取效果最好。结论 该试剂温度适应范围广,能够在一般条件下进行样品处理和核酸提取,耗时短,效率高,使用便捷且生产成本低,具有一定的现场快检应用价值。     

一种适用于乳制品基因组DNA快速提取方法的研究

目的对比NaOH裂解法、PBS裂解法以及直接煮沸法3种方法提取乳制品中核酸的提取效果,优化提取条件,确定一种更适用于现场检测、简便快速的的乳制品DNA快速提取技术。方法以牛奶、水牛奶、牦牛奶、羊奶、骆驼奶、以及驴奶6种常见的乳制品为材料,分别用NaOH裂解法、PBS裂解法以及直接煮沸法3种提取方法提取乳制品中的DNA,并根据裂解液用量和裂解时间进行优化,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,检测DNA提取的质量和灵敏度。结果 NaOH裂解法能够提取所有物种的乳制品DNA,而且可以在最佳裂解条件下提取模拟掺假混合乳的DNA进行检测,发现其检测限能达到1%的牛奶含量。结论该方法取样量小,成本低,在15 min内即可完成快速提取,为实验室乳制品DNA定性或定量鉴别,以及乳制品的现场掺假鉴别提供了一种快速灵敏低成本的样品前处理技术。     

Novel extraction method of genomic DNA suitable for long-fragment amplification from small amounts of milk

Isolation of genomic DNA is a prerequisite for assessment of milk quality. As a source of genomic DNA, milk somatic cells from milking ruminants are practical, animal friendly, and cost-effective sources. Extracting DNA from milk can avoid the stress response caused by blood and tissue sampling of cows. In this study, we optimized a novel DNA extraction method for amplifying long (>1,000 bp) DNA fragments and used it to evaluate the isolation of DNA from small amounts of milk. The techniques used for the separation of milk somatic cell were explored and combined with a sodium dodecyl sulfate (SDS)-phenol method for optimizing DNA extraction from milk. Spectrophotometry was used to determine the concentration and purity of the extracted DNA. Gel electrophoresis and DNA amplification technologies were used for to determine DNA size and quality. The DNA of 112 cows was obtained from milk (samples of 13 ± 1 mL) and the corresponding optical density ratios at 260:280 nm were between 1.65 and 1.75. Concentrations were between 12 and 45 μg/μL and DNA size and quality were acceptable. The specific PCR amplification of 1,019- and 729-bp bovine DNA fragments was successfully carried out. This novel method can be used as a practical, fast, and economical mean for long genomic DNA extraction from a small amount of milk.     

Development of a rapid mitochondrial DNA extraction method for species identification in milk and milk products

Isolation of mitochondrial DNA (mtDNA) from milk offers an effective way to monitor aspects of quality control and traceability to ensure food safety. A few methods of DNA isolation from milk have been reported, but many of them are time consuming and expensive. Here, we report a rapid, simple, and efficient method of mtDNA extraction from raw and processed milk (pasteurized, retorted, and UHT milk) to generate substrate for analysis using any PCR analysis platform. Various techniques used for the separation of mitochondria were explored and combined with a sodium dodecyl sulfate method for mtDNA extraction from raw and processed milk. The optimized protocol supports the efficient amplification of mtDNA independent of sample origin and is sufficiently straightforward to allow its widespread adoption by industry.