利用96孔板和酿酒酵母生长圈复合筛选高产管囊酵母

野生酿酒酵母不能利用木糖作为碳源,但是可以利用乙醇作为碳源和能源。管囊酵母可以利用木糖生产乙醇。酿酒酵母可以利用管囊酵母生产的乙醇作为碳源。本研究将管囊酵母进行紫外诱变后,利用96孔板培养,选取OD值较高的孔进行酿酒酵母生长圈筛选。管囊酵母在木糖(5%)为唯一碳源的YNB培养基上生长并产生乙醇。产生的乙醇越多,指示菌酿酒酵母的生长圈相对越大。利用酿酒酵母生长圈法筛选的正变率为35.22%,筛出1株菌UV171,乙醇产量为10.7 g/L,比对照高25.9%,对菌株UV171进行稳定性实验,传至3代其产量稳定。     

复合诱变选育耐高温产乙醇酵母菌的研究

为获得耐高温产乙醇菌株,对实验室保藏的菌株JZ进行分子生物学鉴定和紫外（UV）-硫酸二乙酯（DES）复合诱变,并通过单因素试验及响应面试验对筛选得到的诱变菌株进行发酵条件优化。结果表明,菌株JZ被鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。经紫外（UV）-硫酸二乙酯（DES）复合诱变,得到诱变菌株JZ-2,且当紫外照射时间为80 s,硫酸二乙酯含量为5%时,在40 ℃条件下发酵6 d,乙醇产量可达4.8%vol。通过单因素试验及响应面试验确定最佳发酵条件为发酵温度40 ℃、初始pH值为4、初始糖度16 °Bx、接种量12%,静置发酵时间6 d。在此优化条件下,乙醇产量达5.6%vol,比优化前相比提高了17%。     

产朊假丝酵母油脂高产菌株的诱变选育

对产朊假丝酵母进行紫外诱变获得高产油脂突变菌株.紫外诱变后筛选出产油量最多菌种.通过正交试验得到产朊假丝酵母产油脂的最优条件:培养温度25℃,培养时间4d,接菌量10%,转速100r/min,在此条件下培养,紫外诱变10s后的产朊假丝酵母产油脂量可达到18%.     

96孔板法筛选抗黑曲霉性乳酸菌及抑菌机理研究

目的:筛选对黑曲霉具有良好拮抗作用的乳酸菌菌株。方法:采用96孔板法进行乳酸菌优良菌株的筛选。研究p H和温度等因素对抗菌特性的影响,利用气相测定菌株DL3无细胞上清液(CFS)中有机酸含量,研究抑菌活性物质;利用扫描电镜分析孢子细胞的完整性,研究抑菌机理。结果:从传统东北酸菜分离的乳酸菌中筛选对黑曲霉具有较强抑制作用的植物乳杆菌DL3,其抑菌率为92.28%。在p H2.5~6.5对黑曲霉具有抑菌活性,并具有良好的热稳定性,121℃处理30 min后抑菌率仅降低5.71%。经气相色谱分析表明菌株DL3 CFS中乳酸、乙酸、丙酸和苯乳酸含量分别为5.743、1.635、0.033、0.085μg/m L,乳酸和乙酸对黑曲霉的抑菌率分别为91.69%和92.04%,丙酸和苯乳酸均无抑菌作用,初步判断菌株DL3的抑菌活性物质为有机酸类。扫描电镜观察表明菌株DL3 CFS破坏了黑曲霉孢子的完整性,导致细胞膜溶解,胞内物质外泄。结论:菌株DL3 CFS中对黑曲霉的抑菌活性主要来自于乙酸和乳酸,可作为米面制品的乳酸菌生物防霉剂的出发菌株。      

高效代谢葡萄糖产乙醇的酵母菌株的选育

以酵母H为出发菌株,运用EMS和紫外线复合诱变育种.在采用0.2MEMS处理5h后,再紫外线照 射15min的条件下,选育出1株H15酵母,其乙醇产率比出发菌种提高20.3%.     

高菊粉酶活酿酒酵母的诱变选育

以安琪酿酒酵母为出发菌株,采用紫外与微波2种物理诱变方法进行复合诱变.经过初筛与复筛,选育出了高菊粉酶活突变菌株Y05,其酶活达到90.97U/mL,约为出发菌株的8倍.经多次传代证明该菌株遗传稳定性良好.当培养基中菊粉浓度200g/L时,经30℃72h发酵突变菌株Y05发酵液乙醇浓度为71.78g/L,乙醇得率为0.43g/g,分别比出发菌株提高了42.5%和13.2%.     

发酵木糖高产乙醇休哈塔假丝酵母突变株的选育

木糖的乙醇发酵是利用木质纤维原料生产乙醇的关键环节。休哈塔假丝酵母是木糖发酵性能较好的天然酵母之一。研究中对Candida shehatae CICC1766进行了紫外诱变和离子注入诱变,力求选育出发酵木糖产乙醇能力强的假丝酵母。先将其进行紫外诱变,得到的突变株S28在木糖添加量为60g/L的条件下乙醇产量为2364g/L,相比原始菌株提高1498%,乙醇得率达到0394g/g(乙醇/木糖)。再对S28进行氮离子注入诱变,得到的突变株SY58乙醇产量为2508g/L,相比S28提高609%,乙醇得率为0418g/g(乙醇/木糖),达到理论得率的908%。进而对SY58菌株进行了5L罐发酵实验,乙醇产量达到2504g/L,得率为0417g/g(乙醇/木糖),同摇瓶发酵结果基本相同,并且发酵时间由原来的72h缩短到52h。     

基于TTC染色法的高活力酵母细胞定量筛选

在2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法及96孔板基础上建立高活力与高产乙醇酵母细胞的同步定量筛选方法。选用体积分数为85%二甲基亚砜作为TTF提取剂,培养液(pH8.0)中TTC添加浓度为0.4%,以96孔板在0%、10%、14%的乙醇浓度下培养27株备选酵母菌株,通过酶标仪测定波长486 nm下TTF吸收值。结果显示TTF吸收值越高,酵母活性越高,并且通过比较酵母活性与其乙醇产量,得出两者在一定程度上呈正相关,即高活性酵母其乙醇产量也较高。共筛得6株具有较高细胞活性的菌株。此方法为高活性、高产乙醇酵母及其他微生物及植物细胞的活性的快速、大量检测提供了一条新途径。     

新型产乙醇重组菌利用葡萄糖和木糖的乙醇发酵

对构建得到的新型产乙醇重组菌JM109(pEtac-PA)、947(pEtac-PA)利用不同浓度葡萄糖或木糖的乙醇发酵进行了初步研究。结果表明,重组菌的乙醇发酵受到发酵碳源的类型、发酵液中糖浓度、发酵培养基的装液量、发酵液的pH值、重组菌的宿主类型等多种因素的影响。以野生型菌株E.coli 947为宿主的重组菌947 (pEtac-PA)发酵产乙醇的能力和乙醇得率均高于JM109(pEtac-PA),尤其是在装液量加大、高浓度糖发酵以及利用木糖发酵时更加明显。     

富硒长双歧杆菌优势菌株的高通量选育

运用96孔深孔板微型化培养和酶标仪快速检测,建立富硒长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）优势菌株的高通量筛选方法。通过高通量筛选获得的富硒长双歧杆菌优势菌株XBL-30,具有很好的硒蛋白转化能力。在7 L罐中添加一定浓度的亚硒酸钠,优势菌株XBL-30的硒蛋白转化率从原始菌株的60%提高至85.3%,菌株多次传代后,硒蛋白转化率均能稳定在85%。该研究建立的高通量筛选方法不仅简单,快速,成本低,而且对其他微生物菌株的高通量筛选具有一定的参考价值。     

复合诱变选育短梗霉多糖高产菌株

以本实验室保存的出芽短梗霉AP8为出发菌株,采用甲基磺酸乙酯(EMS)和紫外线(UV)复合诱变,在EMS终浓度0.4mol/L、作用时间40～60min和30W的紫外灯照射距离30cm、照射时间1.5～2.5min条件下诱变效果好,获得一株稳定遗传的多糖产量高、色素含量低的出芽短梗霉突变株UV60,产量为22.1g/L,对菌落特征和发酵特征的比较发现,突变株UV60在菌落颜色、大小、质地和发酵特性上均明显优于出发菌株AP8。通过对变异株培养基碳氮比和培养基的组成进行单因素和正交试验,其最佳摇瓶发酵培养基组成为：蔗糖50.0g/L、酵母膏1.5g/L、NaCl 1.5g/L、MgSO4 0.3g/L、K2HPO4 2.0g/L、(NH4)2SO4 0.7g/L。采用上述优化的发酵培养基,突变株UV60获得的短梗霉多糖产量为27.24g/L,多糖转化率达54.48%。     

产葡萄糖氧化酶黑曲霉紫外诱变及产酶条件的研究

目的提高黑曲霉中葡萄糖氧化酶的产量。方法紫外诱变法选出产酶优势菌株,优化碳源、氮源、碳酸钙、发酵时间等条件。结果黑曲霉发酵液酶活达到6．5U／mL,比初始酶活提高5倍;单因素条件试验表明,最适碳源是蔗糖,最适氮源是蛋白胨和NaNO3,发酵周期为48h,培养温度是30℃,液体培养基的初始pH值为6．0产酶效果最好。结论紫外诱变后,葡萄糖氧化酶的活力有明显提高。     

复合诱变筛选高产柠檬酸黑曲霉及其发酵研究

采用γ射线(Co60)及亚硝基胍复合诱变的方法对产柠檬酸黑曲霉菌株进行诱变。γ射线(Co60)诱变剂量为1400Gy,亚硝基胍的浓度为1mg/mL,作用时间为4min,在此条件进行复合诱变。经多轮筛选最终获得到一株产酸为15.5g/dL且遗传稳定性高的菌株。并对黑曲霉发酵产柠檬酸的工艺进行优化。确定种子液的最适条件:氮源选取豆饼粉,糖浓度为10%;最适发酵条件:培养温度为35℃,初始pH值5~6,氮源选取豆饼粉且氮源用量为0.8%,在50L发酵罐中进行中试试验,试验结果为周期63h,产酸17.94g/100mL,转化率为99.7%,比出发菌株发酵周期缩短3h,产酸提高10%,转化率提高5%。     

原生质体紫外诱变选育L-半胱氨酸高活力转化菌株

对Pseudomonas sp.HJ-14的原生质体制备和再生条件进行了研究,并对其原生质体紫外辐照诱变选育L-半胱氨酸高活力转化菌株。在37℃、2 mg/mL溶菌酶作用下酶解60 min,其原生质体的形成率和再生率分别为78.6%和28.6%。经过紫外辐照诱变Pseudomonas sp.HJ-14原生质体,在含DL-2-氨基-△~2-噻唑啉- 4-羧酸(DL-ATC)再生平板上筛选抗性菌株,获得1株酶活较高的正突变株B-3,该菌株具有良好的遗传稳定性和酶活稳定性。采用5L罐进行产酶培养,并在pH8.0、DL-ATC·3H_2O浓度为10 g/L、42℃酶促反应9 h,L-半胱氨酸最高产量达4.63 g/L,摩尔转化率为76.5%,较HJ-14提高了117.7%。     

产葡萄糖氧化酶黑曲霉紫外诱变及产酶条件的研究

目的提高黑曲霉中葡萄糖氧化酶的产量。方法紫外诱变法选出产酶优势菌株,优化碳源、氮源、碳酸钙、发酵时间等条件。结果黑曲霉发酵液酶活达到6.5 U/mL,比初始酶活提高5倍;单因素条件试验表明,最适碳源是蔗糖,最适氮源是蛋白胨和NaNO₃,发酵周期为48 h,培养温度是30℃,液体培养基的初始pH值为6.0产酶效果最好。结论紫外诱变后,葡萄糖氧化酶的活力有明显提高。     

异甘露聚糖酶生产菌的诱变育种及固态发酵条件的优化

为了提高异甘露聚糖酶活性,对实验室保藏的一株分泌异甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)进行紫外诱变育种,并优化一株正突变株的固态发酵条件。出发菌株枯草芽孢杆菌K-6的酶活力为206.0U/mL,经紫外线诱变处理后,挑选在培养基上透明水解圈较大的菌株进一步复筛,获得枯草芽孢杆菌K-6-9高产突变株,酶活力为349.3U/mL,高于出发菌株69.6%。连续5代发酵,K-6-9的酶活力范围为343.0～350.3U/mL,表明该突变菌株产酶性能稳定。以K-6-9为菌种,采用单因素试验和正交试验进行最佳固态发酵产酶条件的优化,结果表明：该突变株的固态发酵适宜发酵条件为：发酵时间72h、接种量3%、初始pH 7.5、装料量25g/250mL;培养基组成为：酵母细胞壁添加量8%、料液比1:1.2、麸皮添加量40%,此优化条件下固态发酵K-6-9菌株产酶酶活力最高达601.6U/mL。     

紫外线与氯化锂复合诱变选育L-组氨酸产生菌

以一株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S6为出发菌株,利用氯化锂、紫外线进行诱变,通过实验证明氯化锂诱变剂量在1.2%时致死率达到82.4%,紫外线在照射30 s时致死率达到81.8%.利用氯化锂诱变谷氨酸棒杆菌S6,所得菌株D3的L-组氨酸产量为243 mg/L,比出发菌株提高10.5%;以紫外线做诱变S6,所得高产菌株U1产量256 mg/L,比出发菌株提高8.5%;以紫外线、氯化锂复合诱变S6,所得菌株N1产量为251 mg/L,比出发菌株提高13.6%,结果显示,经紫外线与氯化锂复合诱变后的菌株N1产L-组氨酸的产量最高,比氯化锂诱变后的菌株产L-组氨酸量提高3.1%,比紫外线诱变后的菌株产L-组氨酸量提高5.1%.     

外源乙醇对果糖与葡萄糖酒精发酵的影响

研究了不同体积分数外源乙醇对酵母GJ2008利用等量果糖与葡萄糖混合发酵过程的影响,旨在为高浓度甘蔗汁酒精发酵提供参考和依据。用YPDF培养基模拟甘蔗汁,并调节乙醇体积分数为0%、6%、9%和12%,以初始酵母数为1.12×108个/mL进行酒精发酵,高效液相色谱法测定发酵过程中果糖与葡萄糖含量,并采用曲线下面积法对果糖与葡萄糖代谢曲线进行分析。在外源乙醇体积分数为0%~9%时,酵母GJ2008可以快速利用果糖和葡萄糖进行酒精发酵,但对葡萄糖有着明显的偏好;在外源乙醇体积分数为12%时,果糖和葡萄糖消耗缓慢,生物量得不到有效增加。等质量浓度果糖与葡萄糖混合发酵表明:外源乙醇对果糖代谢的影响明显大于对葡萄糖代谢的影响,外源乙醇体积分数达6%以上时,糖转化乙醇的产量减少了19%~27%。