科氏滑柔鱼和剑尖枪乌贼的多重PCR鉴定

目的:利用单核苷酸多态性(SNP)分子标记设计特异性引物,建立多重PCR体系,实现鱿鱼品种剑尖枪乌贼及其混淆品科氏滑柔鱼的分子鉴定。方法:利用PCR扩增2种鱿鱼品种的细胞色素c氧化酶亚基I(Cytochrome Oxidase Subunit I,COI)的核苷酸序列,通过多重序列比对,发掘了2种鱿鱼品种的单核苷酸多态性位点(SNP)。设计各自的位点特异性引物,并建立了鉴定2种鱿鱼品种的多重PCR体系。结果:在多重PCR体系中,科氏滑柔鱼产生了419 bp的特异性条带,剑尖枪乌贼产生了233 bp的特异性条带,两者的混合品产生了清晰的419 bp和233 bp条带。结论:建立的多重PCR体系不仅可以对科氏滑柔鱼和剑尖枪乌贼进行准确的分子鉴定,而且可以实现对两者混合品的有效鉴定。     

太平洋褶柔鱼及南海鸢乌贼双位点特异性PCR鉴定方法的建立

目的:市场上利用南海鸢乌贼冒充太平洋褶柔鱼作为鱿鱼加工原料的现象时有发生,拟为2种鱿鱼建立一种简单高效的DNA分子鉴定方法。方法:利用从线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)发掘的太平洋褶柔鱼和南海鸢乌贼的SNP位点,分别设计2种鱿鱼的双位点特异性引物,利用多重PCR对太平洋褶柔鱼和南海鸢乌贼进行鉴定和区分。结果:双位点特异性引物在相对温和的退火温度下对2种鱿鱼品种显示了绝对的特异性,太平洋褶柔鱼和南海鸢乌贼分别扩增出了193bp和530 bp的品种特异性条带。建立的多重PCR体系可以有效地对太平洋褶柔鱼和南海鸢乌贼及两者的混合品进行鉴定。结论:多重PCR方法为市场上太平洋褶柔鱼和南海鸢乌贼的鉴定提供了有效的DNA分子手段,并可为太平洋褶柔鱼及其加工产品的原料来源检测提供客观依据。     

新西兰柔鱼与北太平洋柔鱼的品种特异性聚合酶链式反应鉴定

利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增新西兰柔鱼和北太平洋柔鱼的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome C oxidase subunit Ⅰ,COⅠ）基因,通过多重序列比对检测2 种鱿鱼之间的多态性位点。根据2 种鱿鱼的特异性位点分别设计2 种鱿鱼的品种特异性引物,并利用多重PCR实现2 种鱿鱼品种的特异性鉴定和区分。结果表明：建立的品种特异性PCR鉴别体系对新西兰柔鱼和北太平洋柔鱼分别扩增出214 bp和339 bp的品种特异性条带,该方法的检测限低至0.1 ng,且能检测出新西兰柔鱼中1%的北太平洋柔鱼掺入,并能有效检测市场上2 种鱿鱼及其复配鱼糜制品的原料来源。     

基于16S rRNA基因序列鉴定秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼

通过对秘鲁茎柔鱼及澳洲双柔鱼的线粒体16S rRNA基因片段进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增和序列比对,确定2 种柔鱼品种的特异性位点,并由此设计品种特异性引物。利用多重PCR体 系对秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼进行快速、准确地鉴定和区分,并对该体系的灵敏度进行检验。结果表明：在多重 PCR体系下,秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼分别扩增出长度400、229 bp的品种特异性条带,2 种柔鱼的混合样品则同时 扩增出长度400、229 bp的条带;且该多重PCR体系可以检测澳洲双柔鱼中1%秘鲁茎柔鱼的掺入,检测限为0.1 ng。     

多重位点特异性PCR快速检测牛肉中常见掺假动物源性成分

目的:基于动物线粒体cytb基因的多态性位点,建立一种特异性多重PCR体系检测牛肉、猪肉和鸡肉的方法。方法:提取肉类的基因组DNA,利用不同物种mtDNA cytb基因序列的SNP位点的差异,设计特异性引物。进行多重PCR扩增,利用扩增产物片段大小不同,检测牛肉中常见的掺假动物源性成分。通过灵敏性试验,确定最低检测量。结果:实验设计的引物特异性良好,在同一反应体系中,在同一退火温度52℃条件下,牛肉DNA扩增后产生149 bp的特异性条带,猪肉DNA扩增片段为261 bp,鸡肉DNA扩增片段为554 bp,未发生非特异性扩增。且检测的最低浓度达到100 pg/μL,具有高度的灵敏性和适用性。结论:根据动物线粒体cytb基因的差异性位点,开发的多重PCR体系,可一次性地同时检测牛肉、猪肉和鸡肉,可快速、灵敏、高通量地分析食品中掺假动物成分的来源。     

马尾松和云南松花粉的特异性分子鉴定

松花粉是指松科植物马尾松、油松或同属数种植物的干燥花粉,但不同树种来源的松花粉在活性成分的含量上有所差别。因此,准确鉴定松花粉的树种来源对保证松花粉产品质量的稳定性、规范松花粉市场具有重要意义。针对传统性状及化学法在检测松花粉原料的树种来源上的局限性,通过比较不同松树树种的叶绿体基因组序列,在accD基因中挖掘了马尾松和云南松的单核苷酸多态性位点。根据其特异性位点,通过人为引入错配碱基的方式分别设计了马尾松和云南松的特异性引物,并利用多重PCR对不同松树的花粉进行了鉴定。除了松树的特征性条带外,马尾松和云南松的花粉样品还分别产生了168 bp和342 bp的特异性条带。实验建立的多重PCR方法不仅可以将活性成分含量较高的马尾松、云南松的花粉与其他松树花粉及混淆品蒲黄区分,而且可以鉴定市售松花粉产品的原料来源。结果表明,采用叶绿体基因可以对花粉的DNA进行扩增并实现对花粉来源的鉴定。该方法可以作为松花粉原料来源的鉴定体系,保证松花粉产品质量的稳定性,也为松花粉及产品质量的检测标准的完善和补充提供了新的DNA分子标记手段。     

利用外转录间隔区对中国人参和西洋参进行分子鉴定

人参和西洋参是我国两种重要的中药材。两者虽然形态相似,但药性差异较大。为了建立一种简单高效的中国人参和西洋参的分子鉴别方法,作者利用从核DNA的外转录间隔(ETS)发掘的人参和西洋参单核苷酸多态性位点(SNP),分别设计了人参和西洋参的等位基因特异性引物,并利用多重PCR对人参和西洋参进行了鉴定。结果表明,作者建立的多重PCR体系可以有效地对人参、西洋参及两者的混合品进行鉴定。     

多重PCR快速检测三种食品病原菌

建立一种快速、经济、实用的可以同步检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因,沙门氏菌的invA基因,小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因,分别设计了三对引物,对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、灵敏性实验以及优化反应体系。三对引物能特异性扩增出236、475、127bp的目的条带。建立的多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为102CFU/mL、沙门氏菌为102CFU/mL、小肠结肠炎耶尔森氏菌为102CFU/mL。初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的三重PCR方法。     

2种检测变形杆菌PCR方法的比较研究

选取atpD基因作为靶序列设计了2对引物,分别采用不同的PCR扩增条件,对3株变形杆菌属标准菌株,67株样品分离株及13株非变形杆菌属菌株进行扩增实验,结果2种PCR方法对3株标准菌株和66株样品分离株分别扩增出348 bp和596 bp的特异性片断,实验结果呈阴性的1株分离株经全自动微生物鉴定仪鉴定为阴沟肠杆菌。13株非变形杆菌属菌株均未有特异性条带产生。2种PCR方法检测变形杆菌,均具有快速、准确、灵敏、特异的优点。建立的引物2的PCR方法在检测时间、特异性、灵敏度方面比引物1的PCR方法更具优势。     

多重PCR检测婴幼儿配方奶粉中3种食源性致病菌

为建立一种能够同时检测婴幼儿配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的多重PCR检测方法。通过单重PCR验证了9对引物的特异性,筛选出其中3对特异性好的引物建立了多重PCR体系,对其特异性和灵敏度进行评价,并将其应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测。结果表明,针对克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等3种食源性致病菌所筛选的3对引物分别能扩增出469、638和796 bp的目的条带,具有高度特异性。多重PCR检测体系的最佳退火温度为55℃,最佳Mg2+浓度为2.00 mmol/L,最佳引物浓度为400 nmol/L。在此条件下3种目的菌在102 CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带。将建立的多重PCR检测体系应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测,其检出限达到103 CFU/g。本研究初步建立了一种能准确、快速、特异性的检测PIF中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,适用于PIF中3种常见的食源性致病菌的快速检测。     

烟草拟茎点霉快速检测方法的建立

为实现烟草拟茎点霉的快速准确检测,利用真菌rDNA-ITS通用引物对拟茎点霉和其他10种烟草病原菌基因组DNA进行了PCR扩增、片段回收及DNA测序,在序列比对基础上设计了两对特异性检测引物,并鉴定了引物的检测灵敏度和特异性,同时优化建立了PCR反应体系。结果表明,在退火温度为60 ℃时,两对特异性引物P2F/P3R和P3F/P3R从烟草拟茎点霉DNA样本中分别扩增出来420 bp和381 bp的特异性条带,而在其他10种烟草病原菌DNA以及阴性对照中均不能扩增到任何条带。两对特异性引物的检测灵敏度均达到10 pg/μL。建立的基于两对特异性引物P2F/P3R和P3F/P3R的分子检测方法可实现对病原菌烟草拟茎点霉的快速准确检测。      

基于特征基因的不同类型致泻大肠埃希氏菌的分子鉴定

致泻大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的常见病原菌。将传统微生物学方法和分子鉴定方法相结合鉴定致泻大肠埃希氏菌。根据聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和测序建立5种不同类型致泻大肠埃希氏菌的分子鉴定标准,并对试验过程进行安全性评价,最后通过检测鲜肉中肠道集聚性大肠埃希氏菌验证此方法的适用性。结果显示5种致泻大肠埃希氏菌标准菌株的特征基因都有明显的条带,且与该特征基因的产物条带大小一致。同时,胶回收测序的结果与特征基因的序列一致性为100%,可利用PCR和测序鉴定5种致泻大肠埃希氏菌;在安全性评价试验中,利用细菌裂解液进行涂板,培养后均未发现菌落生成,因此没有生物安全隐患;肉样中的检测结果显示,有astA基因的目的条带,且测序结果与此基因序列一致,说明此方法能够准确鉴定出鲜肉中肠道集聚性大肠埃希氏菌。成功建立5种不同类型大肠埃希氏菌的分子鉴定方法,评价试验过程的安全性,并准确鉴定出肉样中的肠道集聚性大肠埃希氏菌,为实验室相关标准的制定和修订提供理论依据和有益借鉴。     

多重PCR鉴定动物源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌方法的建立

建立鉴定空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的多重PCR(mPCR)方法。方法 分别以16S rRNA、马尿酸酶和16S-23S rRNA基因为靶序列设计特异性引物,建立多重PCR方法检测37株菌株样品,同时采用ⁱⁿgene CAM nested PCR检测试剂盒检测验证,进行结果比较分析。结果 该多重PCR方法可扩增出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的特异性条带,其他对照菌株均未扩增出条带,具有较好的特异性;检测敏感性可达0.81pg/μl空肠弯曲菌DNA,0.93pg/μl结肠弯曲菌DNA。多重PCR方法和试剂盒检测结果的符合率为100%,二者与国标GB/T 4789.9—2008方法的符合率达97%以上。结论 本试验建立的多重PCR方法操作快速方便、节约试验成本,具有较好的特异性、敏感性和重复性,可用于弯曲菌的鉴定。     

烟草白粉病抗性基因型的多重PCR检测体系及其在回交育种中的应用

为提高烟草白粉病隐性抗病基因（感病基因）NtMLO1（M1）和NtMLO2（M2）在分子标记辅助选择育种中基因型的选择效率,根据已报道的M1和M2突变基因序列,设计4对单基因特异性引物,组成2个双重PCR反应体系,分别用于同时扩增M1和M2突变型或M1和M2野生型等位基因。结果表明,建立的2个双重PCR体系扩增的特异性片段与单重PCR体系扩增的片段完全吻合,突变基因纯合体只在突变基因多重PCR体系中产生191和306 bp的特异性片段,野生基因纯合体只在野生基因多重PCR体系中产生437和652 bp的特异性片段,杂合体在2个反应体系中均有特异性片段。利用该体系可经过1次或2次PCR扩增准确检测出回交转育过程中回交或自交后代M1和M2的基因型,加快抗病品种育种进程。      

4种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法研究

为快速检测蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和沙门氏菌4种食源性致病菌,建立4重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的检测方法。针对菌株的特异性基因设计引物,选择退火温度相近,扩增条带区间不同的引物为多重聚合酶链式反应引物组,并对多重PCR的引物浓度、退火温度进行优化,确定扩增条件。结果表明,在54℃的退火温度下,4种菌可扩增长度为246、166、65、107 bp的清晰片段,其检测灵敏度为蜡样芽孢杆菌2×101CFU/mL,金黄色葡萄球菌可达1.3×102 CFU/mL,志贺氏菌可达1.3×102 CFU/mL,沙门氏菌可达1.4×102 CFU/mL。     

双向等位基因特异性PCR技术在烟草SNP分型中的应用

为提高抗PVY烟草品种的分子育种效率,本研究针对抗病种质资源半坤村晒烟中隐性抗病基因eIF4E1的SNP位点G149C建立一种简单快速的双向等位基因特异性PCR (Bi-directional PCR amplification of specific alleles,Bi-PASA)检测方法,并对该检测方法的特异性、准确度及实际应用效果进行验证。结果表明,建立的Bi-PASA检测方法能够在一个PCR反应中有效区分eIF4E1基因G149C位点3种基因型:野生型GG、杂合突变型GC、纯合突变型CC。利用Bi-PASA检测方法可以对K326×半坤村晒烟F₂分离群体的基因型进行有效鉴别,且鉴定结果与普通的等位基因特异性PCR (allele-specific PCR,AS-PCR)以及直接测序法的鉴定结果一致。综上所述,本研究建立的Bi-PASA检测方法特异性强、准确度高、操作简便,可更好地应用于eIF4E1基因的分子标记辅助育种。     

多重PCR快速检测婴幼儿奶粉中的病原菌

为了建立同时检测婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的多重PCR方法,根据阪崎肠杆菌ompA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡样芽孢杆菌hblA基因分别设计3对引物进行多重PCR扩增,并对反应条件进行优化。结果多重PCR扩增出长度为514、156、235bp的特异性目的条带。不增菌的情况下,多重PCR同时检测3种病原菌的灵敏度是103cfu/mL,3种病原菌在奶粉中的检出限是104cfu/g。建立的多重PCR反应准确、快速、高效,为同时检测婴幼儿奶粉中的阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌提供了新方法。     

基于lolB和toxR基因的水产品中霍乱弧菌双重PCR检测方法

选择lolB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种针对霍乱弧菌所有生物型菌株的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为519bp和779bp。结果表明:在同步扩增中,仅霍乱弧菌模板可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌模板无任何扩增条带;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测3.42×103CFU/mL菌落数的霍乱弧菌。所建立的基于lolB和toxR两种基因的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于霍乱弧菌检测。     

PCR鉴别猪鸡兔肉方法的建立与应用

建立一种快速准确鉴别生鲜猪肉、鸡肉和兔肉,以及混合或加工过的肉制品中这3种肉成分的方法。以猪肉、鸡肉和兔肉的线粒体细胞色素b基因为特征靶基因设计3组特异性引物对:F/R猪、F/R鸡和F/R兔,通过PCR得到特异性扩增片段,分析电泳图中是否出现目标条带,进而检测肉样是否掺假。结果表明,所设计的引物特异性良好,猪肉DNA扩增后产生331 bp的特异性条带,鸡肉DNA扩增后产生148 bp的特异性条带,兔肉DNA扩增后产生258 bp的特异性条带,而其他肉类未见该特异性条带。该方法准确、稳定,可为猪肉鉴别真假提供技术支持。     

十种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法

为建立能够同时检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌属、克罗诺杆菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌等10种食源性致病菌的多重PCR方法,通过特异性引物的设计、引物特异性验证、引物灵敏度验证和多重PCR检测体系主要反应条件优化,建立多重PCR检测体系,并对其特异性、灵敏度以及人工感染样品应用进行评价。结果表明,建立的多重PCR检测体系可以扩增出10种食源性致病菌的特异目标条带,无非特异扩增。测序结果与目的基因序列进行比对,其序列同源性高达98%,体系灵敏度可达10^-1 ng/μL。人工污染样品应用结果表明,采用多重PCR方法简单快速,仅需简单增菌,检出限可达10 CFU/mL,整个检测时间在48 h以内。建立的多重PCR检测体系特异性强、灵敏度较高,与检验机构实际检测工作联系紧密,具有推广应用价值。