基于高通量测序的宋河浓香型白酒不同窖龄窖泥细菌群落结构分析

以宋河浓香型白酒不同窖龄窖泥为研究对象,采用Illumina Miseq高通量测序技术和典范对应分析（CCA）等方法探究细菌菌群结构变化特征及其环境影响因素。结果表明,16年窖龄窖泥的细菌群落结构多样性高于6年窖龄窖泥,相同窖龄、同一窖池的窖底泥高于窖壁泥。6年窖壁泥与窖底泥的细菌群落结构相似,绝对优势细菌属均为乳酸菌属（Lactobacillus）。16年窖壁泥与窖底泥的细菌群落结构差异较大,共有绝对优势细菌属为梭菌属（Clostridium）、氨基酸杆菌（Aminobacterium）、理研菌属（Petrimonas）、互营单胞菌属（Syntrophomonas）和Sedimentibacter。特有绝对优势细菌属中Lactobacillus相对丰度的降低以及Clostridium和Aminobacterium相对丰度的迅速增长均表明16年窖池已成为趋于老熟化的优质窖池。CCA分析结果推测,pH和有机物可能是影响16年窖池细菌群落结构改变的主要环境因子。     

浓香型白酒窖池中细菌群落结构的研究

为探究浓香型白酒窖池中细菌群落结构和多样性变化，采用HiSeq高通量测序技术，对6个窖池样品中的细菌16S rRNA基因V3～V4区进行测序分析，比较了窖泥和酒醅中的细菌物种组成和丰度，解析了窖泥和酒醅中共有的细菌物种和关键差异物种，探究了浓香型白酒窖池中潜在的关键细菌菌种。研究结果表明，3个窖泥样品共注释到1 009个OTUs,主要分布于厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidete),其中厚壁菌门菌株的丰度超过了60%;3个酒醅样品共注释518个OTUs,主要分布于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。窖泥样品中的细菌物种总数和多样性均高于酒醅样品，窖泥样品中关键的细菌菌种主要来自梭菌属(Clostridium IV)、岩石单胞菌属(Petrimonas)、沉积物棒菌属(Sedimentibacter)、嗜蛋白菌属(Proteiniphilum)和喜热菌属(Caloramator);酒醅样品中关键的细菌菌种主要来自乳杆菌属(Lactobacillus)、丙酸杆菌属(Propioni...     

高通量测序技术解析五粮液窖泥原核微生物群落结构

为清晰认识五粮液特殊窖泥微生态群落结构及功能,利用Illumina NextSeq 500高通量深度测序平台首次分析了五粮液不同窖泥原核微生物群落16S rDNA V4高变区序列;优化了QIIME程序并整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTUs)的数量,分析了不同窖泥中原核微生物群落的丰度、多样性;利用系统发育分析确定了优势菌群的系统发育地位。该研究结果表明,从五粮液窖泥中共获得7 555 164条高质量目标片段。在相同的测序深度条件下(300 000条),五粮液窖泥原核微生物主要由细菌和古菌构成,共检出22个门,52个纲,89个目,168个科,330个属原核微生物,细菌占92.3%,古菌占7.6%。厚壁菌门(Fimicutes)是所有样品的绝对优势菌群(85.6%),共检出74个属,Clostridium、Lactobacillus,Coprococcus,Caldicoprobacter,Soehngenia是丰度最高的细菌属。结合系统发育分析确定窖泥中优势菌群为Lactobacillus,Caldicoprobacter,Caloramater,Clostridium,Caloribacterium,Garciella,Eubacterium,Syntrophomonas,Sedimentbacter,Sporanaerobacter,Tissierella,Methanosarcina,Methanobacterium,Methanobrevibacter,Methanoculleus。五粮液窖泥中蕴藏了显著区别于其他浓香型白酒窖泥的原核微生物群落,尤其是群系复杂的厚壁菌门细菌,较高丰度的产己酸菌群和促进己酸生成的甲烷菌群。     

不同窖龄浓香型白酒窖泥细菌群落结构及其多样性分析研究

以嘉陵江流域金徽酒厂各车间及四川长江流域上部某酒厂老车间窖泥作为研究对象,对陇、川地区浓香型白酒窖泥微生物通过高通量测序的方式,进行基因组提取、OTU划分、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、分类学组成分析,以此为依据对比分析陇、川地区浓香型白酒的窖泥微生物群落组成及多样性差异。样品中共分析出微生物61个纲、289个科和671个属,从分类学组成分析来看金徽酒厂老车间窖泥中优势菌有：Caproiciproducens(25.31%～35.68%)、Petrimonas(15.41%～25.64%)、Syntrophomonas(14.97%～21.68%)、不可培养微生物（10.36%～15.71%）、Proteiniphilum(6.94%～13.85%)、Lactobacillus(8.11%～12.19%)、Sedimentibacter(6.93%～9.74%);四川长江流域某酒厂车间窖泥中优势菌有：Caproiciproducens(21.15%～36.84%)、Petrimonas(2.56%～6.31%)、不可培养微生物（25.23%～32.53%）、不可培养细菌（9...     

Illumina高通量测序技术分析中周羌稞养生酒窖泥细菌多样性

以不同窖龄（5年、10年、20年和30年）的中周羌稞养生酒窖泥为研究对象,利用Illumina高通量测序技术对窖泥细菌16S rRNA V4～V5区进行测序,分析其细菌多样性。结果表明,窖泥中细菌多样性（Shannon指数）和丰富度（Chao指数）随着窖龄的增加而显著提高（P＜0.05）。不同窖龄窖泥的细菌群落组成存在差异,盐扁菌科（Haloplasmataceae）、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）,瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）和梭菌属（Clostridium）为不同窖龄窖泥的共有细菌;类芽孢杆菌属（Paemibacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、消化球菌科（Peptococcaceae）、喜盐芽孢杆菌属（Haloballus）和链球菌属（Streptococcus）只出现在30年窖龄窖泥中;PCA结果分析表明,相同窖龄窖泥中的细菌具有更高的相似性,说明窖龄是影响窖泥细菌群落组成的重要因素之一。     

浓香型白酒窖泥微生物群落研究进展

窖泥微生物是决定浓香型白酒风格的关键因素。多种分子生物学新技术（如以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术、基因组学技术、高通量测序技术等）已用于窖泥微生物群落结构及功能研究,检测到越来越多的窖泥微生物,发现微生物多样性越来越高。老窖泥中的标志性优势微生物,在门水平为厚壁菌门（Firmicutes）、广古菌门（Euryarchaeota）、拟杆菌门（Bacteroidetes）,在纲水平为梭菌纲（Clostridia）,在属水平为梭菌属（Clostridium）、沉积微生物属（Sedimentibacter）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）等。氢营养型甲烷菌既可以促进窖泥的老熟,又对浓香型白酒的香味物质的生成也有重要作用。有些环境因子对窖泥微生物有明显影响,且与有益微生物呈正相关。     

基于Biolog ECO技术分离窖泥细菌的研究

根据窖泥微生物的特性和生长特点,模拟窖泥的微生态环境以不同的培养基和培养条件对微生物进行分离、纯化,用Biolog微生物鉴定系统鉴定,确定窖泥微生物各种菌株.结果显示,细菌含有几大类群,表现出高度的细菌多样性.主要为芽孢杆菌属（Bacillus）、芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus）类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、诺卡氏菌属（Nocardia）、梭菌属（Clostridium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）.     

基于PCR-DGGE技术的古襄阳白酒窖泥微生物多样性分析

为明确湖北省襄阳市古襄阳酒厂新老窖泥的细菌与乳酸菌群落多样性,使用变性梯度凝胶电泳法对窖泥样品中的总细菌与乳酸菌群落结构进行研究。结果显示,古襄阳新窖与老窖窖泥中的微生物群落结构具有极大差异,老窖窖泥中的细菌群落多样性更高,可以分为2个菌门:厚壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes),其中厚壁菌门的细菌最为丰富,可以分为6个科,进一步可分为6个已知属,及3个待定属。总体上来说,老窖窖泥中的细菌以梭菌为代表的厚壁菌门为主;而新窖中的细菌群落结构风度低于老窖,主要以耐酸乳杆菌为主。进一步的研究表明,老窖中的乳酸菌以肠球菌属(Enterococcus)以及乳杆菌属(Lactobacillus)为主。从垂直空间分布上来看,新窖窖泥中的细菌与乳酸菌群落结构并明显变化。     

基于PCR-DGGE技术分析浓香白酒窖泥梭菌多样性

窖泥是浓香型白酒酿制过程中最主要的微生物源,窖泥中微生物的类型、丰度、新陈代谢活动等均对浓香型白酒品质产生很大的影响。为探究窖泥中梭菌微生物的多样性,利用窖泥理化结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术对10个窖泥样品中的梭菌群落及变化规律进行研究。结果表明,所选10个窖泥的理化参数均符合优质窖泥指标要求;在微生物层面,窖泥中检测到的梭菌在属水平上有：嗜碱菌属、丁酸弧菌属、梭菌属、喜热菌属、瘤胃梭菌属、粪球菌属、沉淀杆菌属（Sedimentibacter）、钙原杆菌属（Caldicoprobacter）、温带菌（Tepidimicrobium）、梯氏菌（Tissierella）、孢子菌（Sporanaerobacter）、硫酸盐还原菌属、鲁替孢菌属和梭状芽胞杆菌（Clostridiisalibacter）等,这些菌是优质窖泥的重要指示菌,可知窖泥中含有极其丰富的酿酒功能菌。揭示了可能在白酒酿造中起关键作用的梭菌菌群,在分子水平上为研究浓香型白酒提供了理论依据。     

基于高通量测序的窖泥原核微生物群落多样性在退化窖池中的空间异质性

采用高通量测序技术结合网络分析及多元统计分析方法,研究退化窖池窖壁上层（PW-T）、中层（PW-M）、下层（PW-U）及窖底（PB）窖泥中原核微生物群落、菌群网络及影响微生物群落的理化因素。结果表明,窖泥微生物群落α及β多样性在退化窖池中均存在明显的空间异质性,且窖池退化是一个自上而下的退化过程。随窖池深度增加,窖泥微生物群落α多样性指数整体呈显著上升趋势,如Shannon指数由大到小依次为PW-U（3.38）＞PB（2.51）＞PW-M（1.09）＞PW-T（0.33）（P＜0.05）;窖泥优势菌门由单一的厚壁菌门（Firmicutes）（PW-T和PW-M,约99%）增加至Firmicutes、拟杆菌门（Bacteroidetes）、广古菌门（Euryarchaeota）等6 个门（PW-U）及PB的4 个门。退化窖泥呈现低含水量（平均值32.7%）、低pH值（平均值4.42）及低有效磷（平均值259.27 mg/kg）“三低”的理化特征,其对窖泥微生物群落结构影响较大（冗余分析）。窖泥菌群网络中互呈正相关的微生物主要隶属于不同的纲（占总相关性的78.74%）。同现网络中9 个枢纽总含量非常低（0%～2.84%）,与窖泥pH值或含水量呈显著或极显著正相关（P＜0.05或P＜0.01）;除互营单胞菌属（Syntrophomonas）外,其他枢纽均与乳酸杆菌属（Lactobacillus）呈极显著负相关（P＜0.01）。窖泥pH值与多种理化因子呈显著正、负相关（P＜0.05）,且与群落Simpson指数呈显著正相关,表明pH值可作为一个综合指标用于窖泥质量的初步判断。本实验较系统地研究了窖泥原核微生物群落多样性在退化窖池中空间分布、微生物之间以及微生物和理化因子之间的相关性,为进一步揭示窖泥的退化机制、防治窖泥退化及人工优质窖泥的制作提供一定的理论支撑。     

基于Miseq高通量测序技术的古襄阳酒窖泥细菌多样性评价

使用Miseq高通量测序技术对4份古襄阳酒业浓香型白酒窖泥样品的细菌多样性进行了评价,同时通过选择性培养分离出窖 泥中的优势乳酸菌,再利用16S rDNA序列分析方法,对其进行初步鉴定。 结果表明,乳酸杆菌是古襄阳酒窖池中的优势细菌,其相对 含量高达92.02%。在分类操作单元（OTU）水平上,发现8个核心OTU相对含量＞1.0%,其中7个隶属于乳酸杆菌属（Lactobacillus）。4份 古襄阳酒业浓香型白酒窖泥样品中共分离到12株菌株,初步鉴定其全部为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。     

酱香型郎酒高温大曲、酒醅和窖泥中细菌群落结构分析

该研究利用高通量测序技术对酱香型郎酒大曲、酒醅和窖泥的细菌菌群进行多样性解析和比较分析。结果表明,郎酒窖泥中细菌菌群的丰富度和多样性最高,大曲中细菌菌群的多样性远高于酒醅。窖泥中主要优势细菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）（26.1%）、埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）（12%）、梭菌属（Clostridium）（7.9%）等,嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）作为主体菌,同时存在多种未培养菌种;大曲中的主要优势菌群包括泛菌属（Pantoea）（21.9%）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）（21.4%）、克罗彭施泰特氏菌属（Kroppenstedtia）（19.4%）和乳球菌属（Lactococcus）（9.4%）等;酒醅中主要优势细菌属为片球菌属（Pediococcus）（42.7%）、魏斯氏菌属（Weissella）（32.1%）、芽孢杆菌属（Bacillus）（14.2%）和乳杆菌属（Lactobacillus）（8.3%）,乳酸菌占据优势地位。     

宜宾地区不同性状窖泥的细菌群落结构解析及代谢功能预测

该研究基于16S r RNA V3-V4区基因序列,采用高通量测序技术对宜宾地区不同性状窖泥（新窖泥、老熟窖泥、老化窖泥）的细菌群落结构差异进行分析,并采用PICRUSt预测不同性状窖泥微生物的代谢功能,解析宜宾地区不同性状窖泥的代谢功能差异。结果表明,该地区三种性状窖泥的细菌群落结构存在显著差异,老熟窖泥和老化窖泥细菌群落的丰富度高于新窖泥,而多样性相反。己酸菌属（Caproiciproducens）在老熟窖泥中的相对丰度较高,可能是该地区窖泥老熟的标志,该菌对浓香型白酒的风味物质形成具有重要的作用;乳酸杆菌（Lactobacillus）则在新窖泥中的相对丰度较高,可能是该地区新窖泥的标志。窖泥的碳水化合物代谢和氨基酸代谢功能最强,且其相对丰度同样呈现出老熟窖泥>老化窖泥>新窖泥的变化规律,说明老熟窖泥的细菌群落结构对浓香型白酒风味物质的形成最有利。     

基于高通量测序的窖泥原核微生物群落结构及其理化因子相关性分析

为揭示各项理化特性对窖泥细菌群落结构的影响,分析不同年份窖泥的理化因子差异及与其原核微生物群落的相关性。结果表明：20 a窖池池壁和池底窖泥中的水分、pH值、铵态氮及有效磷和速效钾的含量均显著高于2 a窖泥,但其钙含量却显著低于2 a窖泥。30 a池壁和池底窖泥与2 a相比,除水分含量和腐殖质外,其他指标均存在显著差异。理化因子与菌群的相关性分析发现,水分含量、pH值和铵态氮对菌群的影响最为显著,与Lactobacillus呈极显著负相关（P＜0.01）,与Aminobacterium、Syntrophomonas和Sedimentibacter等6 个菌属呈显著正相关（P＜0.05）。新窖泥中不同的微生物菌群在长期往复的发酵过程中相互作用,优势菌属逐步占据主导低位并达到动态平衡,形成优质窖泥。本实验系统研究窖泥原核微生物群落多样性在窖泥老熟及退化过程中的变化趋势,借助微生物和理化因子之间的相关性分析,为窖池的养护机制及优质窖泥的制作提供一定理论依据。     

浓香型白酒窖泥、出窖糟醅细菌区系的相似性分析

分别建立多粮浓香型白酒窖池的窖泥和出窖糟醅的16S rRNA基因克隆文库,在利用DOTUR1.53软件对691条有效序列进行分析的基础上,对序列进行Blastn和EzTaxon相似性分析。发现窖泥和出窖糟醅中均存在丰富的细菌多样性;窖泥中180条序列分别与糟醅中264条序列100%相似,各占2个克隆文库序列总数的51.14%和77.88%,这些序列主要属于Lactobacillus、Staphylococcus、Serratia、Clostridium 和一些潜在新类群。结果显示：多粮浓香型白酒发酵过程中,窖泥和糟醅具有较高相似度的细菌区系,其间存在较大规模的细菌相互扩散,发生相互扩散的细菌包括Lactobacillus、Serratia和Clostridium等属的菌株及大量潜在新分类单位菌株。     

Comparison of bacterial community in matured and degenerated pit mud from Chinese Luzhou‐flavour liquor distillery in different regions

The bacterial community in the pit mud of a Luzhou‐flavour liquor distillery in different regions was analysed by combined polymerase chain reaction–denaturing gradient gel electrophoresis (PCR‐DGGE) and quantitative PCR (qPCR) in order to distinguish a matured and a degenerated pit mud, judged according to sensory and physicochemical characteristics. The phyla Firmicutes, Cloacimonetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Synergistetes and Unclassified Bacteria were detected. Firmicutes predominated in the pit mud. The diversity and homogeneity of the bacterial community in the matured pit mud were superior to those in the degenerated pit mud in the same distillery. There were significant differences in the bacterial community structure between the matured and degenerated pit mud. Moreover, the bacterial community in the degenerated pit mud samples was similar, which indicated that the bacterial community in the degenerated pit mud did not change within the two different regions. However, the bacterial community in matured pit mud samples was different, demonstrating that there were visible differences in the bacterial community between the samples of matured pit mud collected from the Luzhou‐flavour liquor distilleries in the two different regions. Notably, the quantity of Actinobacteria in the matured and the degenerated pit mud was found to be different by quantitative analysis. Potentially, the Actinobacteria could serve as an indicator bacteria to distinguish between matured and degenerated pit muds. Copyright © 2016 The Institute of Brewing & Distilling     

新老窖泥细菌群落结构差异及其对酿造白酒质量的影响

该实验选取六尺巷酒厂产酒质量低的新窖池窖泥及附近酒厂产酒质量良好的成熟老窖池窖泥,提取总脱氧核糖核酸（DNA）,对细菌16S rRNA的V3-V4区基因进行扩增、高通量测序后分析群落结构的差异。结果表明,螺旋菌门（Spirochaetae）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）是不同浓香型白酒生产厂窖泥样品（标记为YRF、XJF及CXF）中的共有优势微生物;梭菌纲（Clostridia）是成熟窖泥中的绝对优势微生物;在窖泥细菌的系统发育多样性上,新窖泥样品（标记为LCX）中梭菌纲与芽孢杆菌纲（Bacilli）的相对丰度显著低于成熟窖泥,是新窖池产酒质量比成熟老窖池差的主要原因。对窖泥细菌群落结构的分析有助于揭示浓香型白酒质量的成因。