ARTP诱变以及基因组重排筛选具有耐高温性能的酿酒酵母

在工业生产中,酿酒酵母进行高温发酵具有发酵速度快、发酵周期短、发酵原料黏度低、生产成本少并且更适用于同步糖化发酵工艺等优点,因此,选育耐高温的酿酒酵母菌株在工业应用方面具有重要意义。本研究以从工业菌种中分离出来的酿酒酵母AY12作为出发菌株,对其进行常压室温等离子体诱变,在37℃下进行初筛,得到150株单菌落长势较好的菌株。将其进行产孢、杂交以实现基因组重排,在37℃下进行复筛,得到137株生长性能良好的菌株。在35℃玉米水解液中发酵,进行二次复筛,从而获得具有良好发酵性能的14株菌株。最后,进行35℃同步糖化发酵,并测定每菌株的乙醇产量和残糖含量。,最终筛选出7株具有良好耐高温发酵性能的菌株,其中发酵性能最好的菌株为L-38,其同步糖化发酵完成后,乙醇产量为16.20%(V/V),较出发菌株AY12提升了8.00%,残糖含量为35.50 g/L,较AY12降低了32.38%。     

常压室温等离子体(ARTP)诱变选育高核酸酿酒酵母

核糖核酸(RNA)是一类非常重要的生物分子,降解后得到的核苷酸、核苷及碱基具有广泛用途。酿酒酵母是目前生产RNA的主要食品级微生物。本研究采用常压室温等离子体(ARTP)技术进行酿酒酵母诱变育种,利用氯化钾敏感性筛选,多次反复诱变最终得到在以糖蜜为碳源的摇瓶试验中RNA含量为112 mg-RNA/g-DCW,提高了39%的突变菌株Y17aM3。经过对Y17aM3培养条件优化后,确定生产RNA最适接种量为10%,最适p H为5.5,最适温度为26℃,且传代稳定性良好。研究发现在最佳培养条件下,添加磷酸可使Y17aM3的RNA含量提高至119 mg-RNA/g-DCW;添加蛋白胨可使Y17aM3的RNA含量提高至122 mg-RNA/g-DCW。上述结果不仅证明ARTP诱变育种方法突变效果显著,可应用于工业微生物的选育,而且有助于降低基于核苷酸的食品添加剂的生产成本。     

酿酒酵母育种技术的研究进展

由于酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)具有发酵速度快和乙醇产量高等特性,所以一直是生物乙醇和酿酒业主要的发酵菌株,本文归纳总结了酿酒酵母育种技术的研究进展,重点介绍了基因工程育种技术,并对其应用前景进行了展望。      

酿酒酵母的基因育种及其应用

分析了双乙酰、高级醇低生成量酿酒酵母的基因育种及其应用 ,有助于今后工程菌种的科研开发和啤酒发酵工艺水平的提高     

ARTP诱变选育高产油脂酵母菌

从实验室保藏的15株酵母中筛选获得一株油脂产量相对较高的酵母菌KC 8,经96 h摇瓶发酵培养后,油脂产量为1.22 g/L。利用分子生物学鉴定,该菌株的26SrDNA序列与胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)具有100%相似性;以KC 8为出发菌株,经ARTP诱变,最终从300株诱变存活菌株中筛选得到高产油脂突变菌株Y3,经96 h摇瓶发酵培养后,油脂产量为2.38 g/L;对菌株Y3的培养条件进行优化,菌株在葡萄糖为碳源,硫酸铵为氮源,碳氮比为90∶1,培养基初始pH为6.5时,在28℃恒温条件下摇瓶发酵培养96 h后,油脂产量最高达到了3.96 g/L;GC-MS对油脂组分进行分析结果表明,该脂肪酸主要由棕榈油酸、油酸、亚油酸、硬脂酸、二十碳烯酸和二十四烷酸组成,与植物油成分相似。     

耐高温酿酒酵母菌的筛选及发酵性能研究

本研究以市售酿酒酵母为出发菌株,通过常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变,在40℃下进行筛选,获得生长及发酵性能较好的7株酿酒酵母菌株。通过摇瓶发酵验证发现,其中HR-B19(命名为S.C HR)乙醇产量均显著高于对照菌株,发酵残糖、乙醇/甘油均优于对照菌株。进一步对S.C HR进行工业物料小试验证,并测定每株菌的乙醇产量和残糖含量,发现在不控温的高温情况下(35～37℃),工业物料小试验证其同步糖化发酵完成后,S.C HR乙醇产量为15.03%vol,较出发菌株提升了0.21%vol,残总糖2.38 g/100 mL,较出发菌株降低了0.05 g/100 mL。     

葡萄酒酿酒酵母选育与非酿酒酵母混菌发酵研究进展

葡萄酒有着悠久的文化历史,营养全面,口味独特,成为人们餐桌上不可或缺的一种酒精饮料。随着消费人群的日益增多,面对不同的消费群体需要不同风味的葡萄酒来满足需要,原材料葡萄种类、酿酒酵母、酿造工艺都是影响葡萄酒风味的重要因素。随着科技的进步,酿酒酵母得到越来越多人的重视,非酿酒酵母产香气的研究也越来越多。本文综述了目前对酿酒酵母的选育方法和鉴定手段,非酿酒酵母对于葡萄酒产香的部分研究,以期对生产更多独特风味的葡萄酒做出理论上的贡献。     

食品中嘌呤的降低方法及低嘌呤产品研究进展

嘌呤代谢紊乱是引起人体内诸如痛风、肾衰竭等一系列病理表征的重要因素之一。人体从食物中摄取的嘌呤虽少但却几乎都转变成为了诱发痛风、肾衰竭等病症发作的有害物质,因此研发低嘌呤产品具有重要的营养健康价值。以降低高嘌呤食物中的嘌呤为出发点,论述国内外低嘌呤产品的研究进展,并对常见的降嘌呤方法进行分析论述。为低嘌呤产品以后的进一步研究提出了建议。     

整合过表达嘌呤代谢途径关键酶基因提高酿酒酵母菌株环磷酸腺苷产量

调控嘌呤代谢途径关键酶基因表达水平,会影响经AMP→ADP→ATP而生成的c AMP(cyclic adenosine mnophosphate,c AMP)产量。将酿酒酵母编码磷酸核糖焦磷酸合成酶基因PRS1和PRS3、磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶基因ADE4、腺苷酸激酶基因ADK1,分别置于磷酸甘油酸激酶基因PGK1的启动子PGK1p和终止子PGK1t控制下,利用整合载体YIplac211,在菌株GA125中进行整合表达,通过摇瓶实验考察所得菌株的环磷酸腺苷产量。结果表明,在加腺嘌呤条件下,120 h时的c AMP产量分别为(5 380.5±1.91)、(5 189.4±1.72)、(5 131.8±2.05)和(5 199.9±1.62)μmol/L,较菌株GA125分别提高9.8%、5.9%、4.8%和6.2%;此外,ADK1过表达导致一定的生长抑制,所有菌株的腺嘌呤消耗量在(0.399±0.01)~(0.447±0.02)g/L,葡萄糖利用和乙醇产生上彼此没有呈现明显差异。     

常压室温等离子体诱变选育低产挥发酸酿酒酵母

利用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）NX4进行诱变,采用平板初筛、冰酒模拟汁发酵复筛低产挥发酸的突变菌株,并对其遗传稳定性及耐受性进行分析。同时利用该菌株酿造冰葡萄酒,对其理化指标、感官品质及挥发性风味物质进行分析。结果表明,获得一株低产挥发酸的突变体菌株T2-5,其具有良好的遗传稳定性。与原始菌株NX4相比,具有更高的糖耐受性和更低的酒精耐受性,利于在冰酒中应用。利用该菌株酿造的冰酒挥发酸产量降低26.4%,感官评分较高（77.14分）,香气浓郁度有所降低,但持久性增强,具有典型的花香、蜂蜜、蜜桃、柠檬、甜瓜等热带水果香气。     

常压室温等离子体诱变选育富硒纳豆芽孢杆菌

纳豆芽孢杆菌可以转化亚硒酸钠为有机硒。对一株纳豆芽孢杆菌的生长曲线进行测定,确定了亚硒酸钠适宜的添加时间和添加量。以纳豆芽孢杆菌BSN424为出发菌株,采用常压室温等离子体诱变系统进行诱变,根据耐硒和富硒能力筛选,经连续传代培养后筛选出了富硒纳豆芽孢杆菌。结果表明,适宜加硒时间为培养后3 h,培养时间为24 h,培养基适宜硒质量浓度为6μg/mL,常压室温等离子体诱变系统功率为100 W,诱变时间为25 s。诱变后筛选得到一株具有较高富硒能力的诱变菌株BN-44,经摇瓶发酵后的富硒量为1136.43μg/g,相比出发菌株的742.12μg/g提高了53.13%。研究表明常压室温等离子体诱变育种能有效地对纳豆芽孢杆菌BSN424进行诱变,旨在为有机硒生物转化法中寻找益生菌富硒载体及其诱变育种提供一定依据。     

产脂肪酶菌株的常压室温等离子体诱变及高通量筛选方法的建立

脂肪酶由于可催化的反应种类和底物类别多,且具有位置选择性和异构体选择性等特点而常用于结构酯的合成和油脂改性等领域。丝孢酵母(Trichosporon sp.)是一种产脂肪酶菌种,但生产能力偏低是限制该菌实现工业化生产的重要因素。本研究利用常压室温等离子体(ARTP)对丝孢酵母野生菌进行诱变处理,并建立了96孔板培养结合对硝基苯酚棕榈酸酯(P-NPP)法测定酶活力的高通量筛选方法,实现了60个突变菌株的初筛。以酶活力为筛选指标时,突变率和正突变率分别为51.7%和28.3%。8株初筛菌株的摇瓶发酵结果显示,A13和A5的产酶提高最显著,培养96 h后分别比野生菌增加2.64倍和1.54倍,且2个突变菌株的遗传稳定性良好。对比研究发现,突变菌株A13相较野生菌的最大优势在于提前24 h便能达到最高产酶量。     

常压室温等离子体诱变与微生物微液滴培养选育谷胱甘肽高产菌株

为提升野生毕赤酵母菌株BY-1产谷胱甘肽的能力,通过常压室温等离子体（atmospheric and room temperatureplasma,ARTP）诱变技术得到诱变菌株BY-1-26。进一步在摇瓶培养过程中添加1,2,4-三氮唑,提高诱变菌株产量。最后将1,2,4-三氮唑作为筛选因子,利用微生物微液滴培养（microbial microdroplet culture system,MMC）仪对诱变菌株进行适应性进化,获得了1株高产谷胱甘肽的突变株BY-2-24,并对其遗传稳定性进行研究。结果表明：出发菌株BY-1经过ARTP诱变处理、抗性梯度平板初筛、MMC适应性进化、摇瓶复筛等,可以选育高产谷胱甘肽突变株。突变株BY-2-24摇瓶产量达（312.13±2.62）mg/L,较出发菌株提高134.26%,且经过7次传代培养,仍然具有较好的遗传稳定性。同时,生物量提高118.33%,表明诱变菌株的生长能力得到提高。研究表明,ARTP与MMC联合应用作为一种简便高效的微生物诱变方式,可用于定向诱变筛选高性能微生物菌株,为高通量选育目标菌株提供了参考。     

等离子体诱变凝结芽孢杆菌提高木糖利用能力高产L-乳酸

为进一步提高凝结芽孢杆菌发酵木糖生产L-乳酸的产量和转化率,以实验室保存的一株能利用木糖产L-乳酸的野生型凝结芽孢杆菌菌株NL01为出发菌株,通过等离子体诱变育种技术和平板菌落初筛、摇瓶复筛,最终得到一株木糖耐受力强、L-乳酸产量高、遗传特性稳定的正向突变菌株NL-CC-17。该突变菌株是目前已报道的木糖耐受力最高的菌株。当以100 g/L的木糖为底物,50 ℃发酵72 h后,L-乳酸产量达到82.30 g/L,糖酸转化率为92.37%,L-乳酸产量较出发菌株提高21.51%,糖酸转化率提高了16.00%。通过初步优化发酵条件,确定该菌株最佳发酵温度为50 ℃,实验范围内最佳发酵pH值为5.5。     

常压室温等离子体诱变选育耐酸酿酒酵母菌株

利用常压室温等离子体(ARTP)诱变方法对实验室保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-62进行诱变,通过试验确定最佳诱变条件为处理时长80 s,此条件下菌株SC-62致死率84%。将诱变获得的菌株进行初筛、复筛和发酵性能测定。结果显示,筛选出一株耐酸性强、发酵性能优良的正突变菌株A-107,其在pH为2.5的发酵培养基上培养6 d后测得的发酵力[6.21 g CO2/(100 mL·24 h)]和酒精产量(11.52%vol)较出发菌株SC-62分别提高了37%和30%,突变菌株A-107可耐受16%乙醇、100 g/L NaCl、500 g/L葡萄糖,耐受性和遗传稳定性良好。     

常压室温等离子体诱变选育耐酸酿酒酵母菌株

利用常压室温等离子体(ARTP)诱变方法对实验室保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-62进行诱变,通过试验确定最佳诱变条件为处理时长80 s,此条件下菌株SC-62致死率84%。将诱变获得的菌株进行初筛、复筛和发酵性能测定。结果显示,筛选出一株耐酸性强、发酵性能优良的正突变菌株A-107,其在pH为2.5的发酵培养基上培养6 d后测得的发酵力[6.21 g CO2/(100 mL·24 h)]和酒精产量(11.52%vol)较出发菌株SC-62分别提高了37%和30%,突变菌株A-107可耐受16%乙醇、100 g/L NaCl、500 g/L葡萄糖,耐受性和遗传稳定性良好。     

高产谷胱甘肽酵母菌株的选育

以BY-14面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）为出发菌株,通过紫外线和氮离子注入复合诱变,氯化锌、乙硫氨酸耐性平板筛选,获得一株高产谷胱甘肽的面包酵母优良菌株（S．cerevisiae）BL-23。该菌株经摇瓶发酵谷胱甘肽产量为113．46mg／L,较出发菌株提高62％,每1g干细胞含谷胱甘肽20．86mg,较出发菌株提高56％。传代培养结果表明,该菌株具有稳定的遗传性能。