调整葡萄糖转运系统提高大肠杆菌L-苏氨酸产量

葡萄糖的有效利用是提高大肠杆菌合成L-苏氨酸能力的关键,作者通过优化葡萄糖转运来提高大肠杆菌L-苏氨酸合成能力。利用CRISPR基因编辑技术在大肠杆菌TWF001中分别敲除了PTS系统关键基因ptsH和ptsG,并在30 g/L葡萄糖质量浓度下进行了摇瓶发酵。与对照菌株TWF001相比,TWF001ΔptsH和TWF001ΔptsG合成L-苏氨酸能力均有明显改善;TWF001ΔptsH L-苏氨酸产量提升38.02%。在TWF001ΔptsH基因组上用trc启动子过表达galP基因,构建了TWF001ΔptsH,Ptrc：：PgalP。对3株突变菌在40、50、60 g/L葡萄糖质量浓度下进行了摇瓶发酵;36 h后TWF001ΔptsH,Ptrc：：PgalP在40 g/L葡萄糖质量浓度时,L-苏氨酸产量达到26.16 g/L,糖酸转化率为0.65 g/g,L-苏氨酸产量提升幅度达42.12%。研究结果说明优化葡萄糖转运可以有效提高大肠杆菌L-苏氨酸合成能力。     

色氨酸转运系统改造对大肠杆菌产L-色氨酸的影响

近年来,转运系统改造已经成为氨基酸菌株菌种改良的重要手段。本研究以工业生产菌Escherichia coli MT-01/p Trp-01为出发菌株,首先利用Red重组技术,在菌株MT-01/p Trp-01基因组上敲除了色氨酸吸收基因mtr,发酵结果表明,敲除敲除突变菌的L-色氨酸产量达到35.87 g/L,与出发菌株E.coli MT-01/p Trp-01相比提高了32%;在此基础上,进一步考察了三种不同启动子（Pr,Ptac,Pser A）控制下L-色氨酸分泌基因ydd G的差异表达对菌体生长及菌株产L-色氨酸的影响。结果表明,当采用组成型启动子tac时,ydd G基因的过表达菌株L-色氨酸的产量为41.01 g/L,比mtr敲除菌株E.coli MT-11/p Trp-01的产量提高了14.3%,当采用温度诱导型启动子Pr调控ydd G基因表达时,L-色氨酸的产量与mtr敲除菌株E.coli MT-11/p Trp-01的产量相比提高了9.3%,L-色氨酸的产量达到了39.22 g/L;而采用基因ser A的天然启动子调控ydd G表达时,菌体的生长受到了明显抑制,L-色氨酸产量仅有27.1 g/L的色氨酸。综上,大肠杆菌基因mtr的敲除和基因ydd G的过表达均可以有效提高工程菌株生产色氨酸的能力。      

大肠杆菌PTSNtr相关基因缺失对苏氨酸合成的影响

大肠杆菌的氮磷酸转移酶系统（nitrogen phosphotransferase system,PTSNtr）在其工作过程中会消耗L-苏氨酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸,敲除相关基因或可影响苏氨酸合成。作者利用CRISPR-Cas9系统,分别敲除PTSNtr相关基因ptsP、ptsO和ptsN,构建得到突变株MZ001、MZ002和MZ003。通过对出发菌株和突变菌株测定生长曲线,发现ptsP、ptsO和ptsN的单缺失使菌株培养前期生长迟缓,迟滞期延长,后期快速生长,稳定期生物量积累大于出发菌株。之后在出发菌株和突变菌株中引入含有苏氨酸合成的3个关键酶编码基因thrA*、thrB和thrC以及苏氨酸转运蛋白编码基因rhtC的表达质粒。对比菌株MG1655/pFW01-thrA*BC-rhtC,菌株MZ001/pFW01-thrA*BC-rhtC、MZ002/pFW01-thrA*BC-rhtC和MZ003/pFW01-thrA*BC-rhtC苏氨酸的产量有明显提高,分别为3.805、1.722、3.091 g/L。本研究表明,大肠杆菌的PTSNtr相关基因的敲除对提高其L-苏氨酸的合成能力有促进作用。     

L-苏氨酸发酵过程中乙酸的控制

大肠杆菌是表达外源基因常用的宿主菌,然而在培养过程中容易发生副产物乙酸的积累,不仅造成碳源的浪费,而且严重抑制菌体生长及外源基因的表达.本研究利用一株自主构建的大肠杆菌基因工程菌(MHZ0200-2)发酵生产L-苏氨酸.通过选择合适的发酵条件来控制其副产物乙酸的生成,从而提高L-苏氨酸的产量.L-苏氨酸的初始产量是0.09g/L,培养条件优化后产量提高到2.06g/L.     

碳源对L-苏氨酸发酵的影响

以L-苏氨酸生产菌TRFC为供试菌株,研究了碳源对L-苏氨酸发酵的产量和糖酸转化率的影响。采用补料分批发酵工艺生产L-苏氨酸,利用氨基酸分析仪测定发酵液中L-苏氨酸的产量。确定了发酵的最佳碳源及其补料方式,通过10L罐补料分批发酵36h,产酸可达118.9 g/L,糖酸转化率为47.6%。     

高产L-苏氨酸的缺陷型大肠杆菌发酵条件优化研究

采用选育高产大肠杆菌,对原发酵培养基配方中葡萄糖、玉米浆和硫酸铵配比含量及摇瓶工艺的摇床转速、温度、培养基装液量和菌液接种量优化,测定不同条件下的L-苏氨酸含量。结果表明,以5%的接种量,37 ℃,220 r/min条件下,发酵培养基中葡萄糖含量为41.0 g/L、玉米浆含量为11.0 g/L和硫酸铵含量为20.0 g/L时,赖氨酸缺陷型菌株的L-苏氨酸产量为5.90 g/L,与优化前(4.06 g/L)相比产率提高了45.32%,甲硫氨酸缺陷型菌株的L-苏氨酸产量为5.76 g/L,比优化前相比(3.89 g/L)产率提高了48.07%。     

L-2-氨基丁酸大肠杆菌生产菌株的构建

L-2-氨基丁酸作为新型药物的关键手性前体,在化工和制药行业应用广泛。该文以1株生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli) THRD为出发菌株,逐步延伸代谢途径,构建了L-2-氨基丁酸高产菌株。首先,分别把苏氨酸脱水酶编码基因ilv A2和ilv A4在THRD中过表达,菌株THRD/p Trc99a-ilv A2在5 L发酵罐中分批补料发酵,2-酮基丁酸积累量达到18 g/L。然后,分别与ilv A2串联表达酪氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶编码基因tyr B、gdh和bcdBS,将L-2-酮基丁酸转化为L-2-氨基丁酸,菌株THRD/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量达到19 g/L。最后,研究了阻断L-苏氨酸输出途径对发酵的影响,菌株THRDΔrht C/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量提升至22 g/L。因此,通过代谢途径延伸可以有效地将L-苏氨酸生产菌株转变为L-2-氨基丁酸生产菌株。该研究为L-2-氨基丁酸高产菌株的构建奠定了基础,且对其他延伸代谢途径获得新产品的代谢工程研究提供了参考。     

L-苏氨酸发酵法工业生产的研究

采用乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum) ZT-1株进行5001和6000罐L-苏氨酸发酵扩大试验,在以工业葡萄糖、硫酸铵为主原料的培养基中发酵,可产20g/1以上的L-苏氨酸,最高达到24.8g/1。发酵液经离子交换法提取和结晶法精制,获得符合国内外药典标准的医药级产品,收率可达40%以上。现已实现工业化批量生产。     

微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展

L-苏氨酸作为一种必需氨基酸被广泛用于食品、饲料、医药及化妆品行业。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵法生产。代谢工程技术的应用为菌种选育开辟了有效途径,使在现有高产基础上进一步提高氨基酸的产量成为可能。作者对两大氨基酸生产菌——大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中的L-苏氨酸生物合成相关途径、代谢调控机理以及运用代谢工程技术提高L-苏氨酸产量所取得的成果进行了系统综述。     

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,利用基因重组技术替换ilvLXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,以期获得L-异亮氨酸生产菌.将ilvLXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilvLXGM后获得ILE01菌株,于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvIH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,获得菌株ILE02和ILE03,其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19g/L.针对ILE03 α-酮丁酸积累量过高的问题,通过改变操纵子中ilvA和ilvIH的顺序调节其转录水平,获得菌株ILE04,其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L.利用ILE04于5L发酵罐中进行发酵实验,L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/(L·h)及4.6％.     

抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的载体蛋白

抗菌肽是天然免疫系统的主要成分,能有效抵御病原微生物的侵害。目前其作为新型药物受到人们很大的关注,由于从天然资源中分离或化学合成成本较高,因此应用基因重组技术生产抗菌肽很迫切。本文主要讨论了抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达、融合表达中常用的载体蛋白及新的融合载体SUMO（小泛素修饰因子）的主要性能。     

大肠杆菌在茶叶中的存活及相关抑制效应的研究

本文对大肠杆菌在红茶、绿茶和乌龙茶中不同时间的存活率进行了研究。结果表明,不同品种的茶叶对大肠杆菌的抑制效应有显著差异。大肠杆菌在红茶中的存活时间最短,为36h,在乌龙茶中存活的时间最长,为144h。对多批茶叶生产过程中污染的大肠杆菌,24h后跟踪检测,其结果证实了红茶和绿茶对大肠杆菌显著的抑制效应。对茶叶抑制大肠杆菌作用机理进行了探讨,为当前控制茶叶中大肠杆菌的污染问题提出了新的证据和启示。     

双歧杆菌细菌素bifidocin A对大肠杆菌细胞总蛋白表达的影响

为从蛋白表达水平探讨细菌素bifidocin A对革兰氏阴性菌（G－）的抑菌作用机理,利用双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）联合蛋白质基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser analytical ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）技术分析细菌素bifidocin A处理前后G－大肠杆菌1.90细胞总蛋白表达差异情况,并在基因本体论注释基础上,对差异表达蛋白进行功能分类及富集分析。研究结果表明,经细菌素bifidocin A处理后,大肠杆菌（Escherichia coli）CGMCC1.90共有12 个差异蛋白点,其中2 个蛋白表达上调,10 个蛋白表达下调;MALDI-TOF MS共鉴定得到10?个差异表达蛋白,主要涉及细胞膜组成、能量代谢以及应激反应等方面。这些结果揭示细菌素bifidocin?A可能是通过改变细胞膜结构、阻断三羧酸循环、减少能量和三磷酸腺苷提供以及降低细胞对外界胁迫条件的抵抗能力等达到对大肠杆菌的抑菌效果。     

高效合成L-高丝氨酸大肠杆菌基因工程菌株的构建

针对现有L-高丝氨酸生产菌株因营养缺陷需在发酵过程中添加L-苏氨酸等物质的问题,以大肠杆菌为底盘细胞,构建1株非营养缺陷型L-高丝氨酸高产菌株.首先通过下调thrB和thrC的转录弱化L-高丝氨酸的降解途径;并过表达thrA、ppc和pntAB以强化L-高丝氨酸合成代谢流、提高前体物以及辅酶供应;在此基础上过表达rht...     

大肠杆菌cdd和thrA基因的敲除及其对胞苷积累量的影响

以大肠杆菌AU39作为出发菌株,通过基因工程手段对其进行改造,旨在提高胞苷产量。首先,通过Red重组系统敲除了大肠杆菌AU39基因组上的胞苷脱氨酶基因cdd,阻断了胞苷的分解代谢;敲除了E．coliAU39（Acrid）基因组上的高丝氨酸脱氢酶基因thrA,阻断天冬氨酸向高丝氨酸的代谢途径。然后,分别对不同基因缺失菌株进行培养发酵,与出发菌株E．coliAU39相比,两株突变株都有不同程度的胞苷积累,E．coliAU39（Acdd）与E．coliAU39（AcddAthrA）的胞苷产量提高了1．25倍与1．6倍,而尿苷产量均相对有所降低。     

胡桃醌对大肠杆菌细胞膜的作用研究

通过考察胡桃醌对大肠杆菌细胞膜的作用来研究胡桃醌的抑菌机理。采用3种不同质量浓度的胡桃醌作用于大肠杆菌后,测定培养液中的相对电导率、蛋白质质量浓度和细胞内外K+、Na+含量的变化,并结合透射电镜图来分析胡桃醌对大肠杆菌细胞膜的影响。结果表明:胡桃醌能够改变大肠杆菌细胞膜的渗透性,大量带电离子和蛋白质外漏;菌体细胞内外K+、Na+含量与空白对照组相比变化显著。透射电镜观察,经胡桃醌作用后菌体细胞被破坏,细胞膜变薄,细胞个体之间界限变模糊,内容物流出。并且,随胡桃醌质量浓度的增加和作用时间的延长,对大肠杆菌细胞膜的破坏越显著。显示胡桃醌的抑菌活性与其对大肠杆菌细胞膜的破坏有直接关系。     

营养因子对重组大肠杆菌产β-胡萝卜素的影响

研究了各种营养因子对重组大肠杆菌产β-胡萝卜素的影响,以葡萄糖10g/L和蔗糖10g/L为复合碳源,牛肉膏4g/L为氮源有利于菌体生长和β-胡萝卜素的表达,添加微量因子NaCl、Span-20和KH2PO4有利于β-胡萝卜素的表达,而对细胞生长作用不明显,最佳添加浓度分别为1.6、0.7和3g/L.     

大肠杆菌E881产苯丙氨酸转氨酶培养基的优化

通过正交试验,确定了大肠杆菌E881产酶的最佳培养基为:葡萄糖(1.5%)酵母膏(1%)KH2PO4(0.3%)(NH4)2SO4(0.2%)。以此培养基培养出来的游离细胞为酶源,在底物浓度为0.2mol/L时进行转氨反应,反应6h,底物摩尔转化率达到90%以上。     

Surfactin 抑制乳中大肠杆菌O157 活性研究

本研究采用牛津杯法和倍比稀释法测定大肠杆菌O157对Surfactin(生物表面活性素)的敏感性,并通过检测对大肠杆菌O157 生长曲线、杀菌率、杀菌动力学的影响探讨Surfactin 对大肠杆菌O157 的杀菌特点,最后测定了Surfactin 对鲜乳中大肠杆菌O157 的杀菌效果。结果表明,大肠杆菌O157 对Surfactin 敏感性较高,其最小抑菌浓度(MIC)为25μg/ml,Surfactin 不仅具有抑制大肠杆菌O157 的作用,还具有明显的杀菌效果。2MIC Surfactin 作用于鲜乳介质中的大肠杆菌48h 后,大肠杆菌不被检出。