常见转基因大米数字聚合酶链式反应多重定量检测方法研究

目的 建立4种转基因(genetically modified, GM)大米成分多重定量检测方法, 解决混合转基因产品和多品系杂交的多价转基因产品的高通量精准定量难题。方法 采用Raindrop微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)方法对4种常见转基因大米TT51-1、克螟稻、科丰6号、M12品系特异性基因和大米蔗糖磷酸合成酶基因逐一进行拷贝数分析, 并将其转化为含量百分比。结果 转基因含量在0.1%~100.0%范围内的4品系转基因大米混合样品的定量体系线性关系良好, 标准曲线r2值均在0.99以上, 定量相对灵敏度可达0.1%, 相对误差和相对标准偏差值均小于25%, 定量准确性和精密度符合国际通用要求。结论 本研究成功建立了4种常见转基因大米成分的多重定量检测方法, 解决了常规方法一次只能定量分析单一样品的缺点, 为大米、稻谷及其初加工产品中多种转基因成分的高效定量提供了新的技术手段。     

双重数字聚合酶链式反应定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系

目的 建立双重数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法精准定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系的方法。方法 基于马铃薯内源UGPase基因和EH92-527-1品系外源插入片段旁侧序列,设计合成引物和探针,确定反应体系和反应条件,建立转基因马铃薯EH92-527-1品系双重数字PCR定量检测方法。对方法的特异性、定量检测范围、定量检出限、检测准确度进行评估。结果 该方法特异性良好,除转基因马铃薯EH92-527-1品系外,其他物种和品系均无扩增;在线性范围内,内参基因和品系特异性基因拷贝数的相对标准偏差值介于 0.86%～22.90%（＜25%为可接受的范围）,线性决定系数R2＞0.99;品系特异性基因的定量检出限为3拷贝;不同浓度样品EH92- 527-1品系含量测定值与真实值之间的偏差分别为1.54、4.92和-1.31。结论 方法具有良好的重复性和准确度,可以用于进出口产品中转基因马铃薯EH92-527-1成分的定性定量检测。该方法的建立对于转基因马铃薯及其制品的监控监管、安全评价和风险预警具有重要意义。     

转基因甜菜品系H7-1的数字PCR定量检测方法

为实现转基因甜菜品系H7-1的标识管理和精准定量,根据H7-1的5’边界序列和甜菜谷氨酰胺合成酶基因（glutamine synthetase,GS）设计引物和探针建立双重数字PCR检测体系。该方法的特异性、灵敏度、精密度和准确度均进行了测试。结果显示：建立的转基因甜菜H7-1数字PCR检测方法特异于H7-1品系检测,在20 μL反应体中H7-1品系特异性序列和内源基因GS的定量下限（limit of quantitation,LOQ）分别为3.1拷贝/μL和6.3拷贝/μL,检测下限（limit of detection,LOD）检出限分别为0.6拷贝/μL和1.3拷贝/μL,精密度和准确度在可接受范围内,该定量方法不依赖于标准曲线建立,可便捷的应用于转基因甜菜H7-1成分的精确定量检测。     

转基因成分定量检测技术研究进展

转基因作物的种类以及含有转基因成分的产品在日益增长,转基因产品的安全性也越来越被社会公众广泛关注。世界各国均颁布转基因安全管理、标识法规,对转基因生物及其加工产品进行标识和管理。如何准确、稳定地对转基因产品中的转基因成分进行定量,已成为转基因产品检测技术研究的重要方向。本文综述了竞争性PCR、荧光定量PCR以及数字PCR等定量检测技术在转基因成分检测中应用及研究进展,讨论了目前各类转基因定量检测技术的优缺点,并在此基础上展望了定量检测技术在转基因成分检测领域的发展前景。      

转基因食品的定量PCR检测方法

近年来转基因食品定性检测方法发展迅速,然而目前转基因成分(GMO)的准确定量检测在国际贸易中日趋重要.我们这里介绍三种定量检测方法半定量PCR法,定量竞争PCR(QC-PCR)法和实时定量PCR法.半定量PCR法比较简单,但结果不是很精确.定量竞争PCR的特点是含有内部标准子.近来开展的实验室合作研究表明,与定性PCR法相比,定量竞争PCR降低了实验室之间的误差.而实时定量PCR法可在提取DNA后3h内,测出每克起始样品的总DNA量及2pg转基因成分的量,但这套PCR系统目前价格昂贵.     

荧光PCR和数字PCR法检测转基因DAS-44406-6品系大豆

目的：建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定性检测方法和使用数字PCR检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定量检测方法。方法：针对转基因DAS-44406-6大豆品系,进行5’-RACE,测定该品系转基因大豆外源片段与大豆染色体重组的边界序列,并根据该边界序列设计引物和探针。使用23 种非DAS-44406-6品系转基因植物作为阴性对照测试实时荧光PCR引物和探针的特异性,以DAS-44406-6品系样品制备6 个含量梯度的样品进行检测低限实验。使用数字PCR技术进行定量检测,并确定定量检测的低限。结果：建立的转基因DAS-44406-6大豆品系的实时荧光PCR特异性检测方法品系鉴定特异性较强,实时荧光PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为100 ng/反应时,为0.01%的转基因大豆含量,约为16.6 个拷贝的DAS-44406-6基因组DNA;数字PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为0.5 ng/反应、转基因大豆含量为1%时,相对标准偏差为0.7%。因此,建立的转基因DAS-44406-6大豆品系实时荧光PCR和数字PCR特异性检测方法符合转基因检测的要求。     

转基因大豆MON89788双重数字PCR通用定量检测方法的建立

建立一种特异、稳定、灵敏、通用的转基因大豆MON89788品系双重数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction,dPCR）定量检测方法,在一个体系内同时进行内外源基因的定量检测,适用于微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）和芯片式数字PCR（chip digital PCR,cdPCR）平台,并通过了食品分析能力评价体系国际能力验证项目的盲样检测评价。ddPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为8.0copies/μL和8.2copies/μL;cdPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为7.443copies/μL和7.646copies/μL;ddPCR和cdPCR对转基因大豆MON89788品系成分相对含量的相对定量限均为0.1%。     

微滴式数字PCR定量检测转基因玉米品系VCO-01981-5

建立基于QX100微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)平台的我国未批准转基因玉米品系VCO-01981-5的二重微滴式数字PCR定量检测方法。该方法选择基因组中单拷贝的玉米内源基因hmg和VCO-01981-5品系边界序列为定量靶序列,分别设计不同的PCR扩增引物和TaqMan探针,并对两种探针用不同的荧光进行标记,然后将上述探针和引物置于同一个PCR反应体系中以同时定量两个靶标序列。特异性实验结果显示该法只有VCO-01981-5品系的两个靶序列才都有扩增信号。灵敏度、线性和准确性实验结果显示在定量结果相对标准偏差不大于25%时,最低可稳定定量5个拷贝的VCO-01981-5品系特异性序列分子和4个拷贝的内源基因hmg分子;而在高达50 ng模板DNA以下范围内,PCR反应模板量与测定样品拷贝数之间呈高度正相关,相关系数达0.99以上;平均误差小于10%。结果表明本研究建立的该玉米品系定量方法特异性强,稳定性好,精确性、准确性以及灵敏度高,定量范围广,可用于进、出口农产品和食品中该转基因玉米品系成分的定量检测。此外,该法还可为其他转基因玉米品系及其他转基因作物品系建立类似定量检测方法提供参考。     

基于双重微滴式数字PCR对转基因油菜RF1品系的定量方法

基于微滴式数字PCR平台,建立了一种在同一个微滴反应体系中同时检测油菜样品中两种靶标序列的双重微滴式数字PCR(duplex-ddPCR)定量分析方法。试验结果表明,内参基因和品系特异性基因均能特异性扩增出来,所建立的RF1品系duplex-ddPCR方法特异性好。在单位体系内参和外源基因拷贝数位于18~23077的区间内可以呈现出良好的线性,r2=0.999。经验证,本方法的定量检测限(LOQ)和最低检测限(LOD)分别为18拷贝/反应和3.7拷贝/反应。精密度试验结果表明两组浓度的DNA样品所得到的平行试验结果的标准偏差(relative standard deviations,RSD)介于8.40%~24.50%,准确度试验结果显示标准偏差RSD值介于5.97%~12.64%,均达到了对方法精密度RSD和准确度RSD小于25%的要求。综上所述,本研究所建立的duplex-ddPCR定量分析方法可用于转基因油菜RF1的定量检测。     

实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立

采用实时荧光定量PCR技术 ,通过使用特异的引物和探针 ,对大豆中的内源基因Lectin和转基因大豆中的外源基因EPSPS进行了定量检测 ,建立了Monsanto公司生产的商业化转基因大豆Roundup Ready○R的定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度 <0 0 1% ,是国际上设定的转基因最低限量的 10 0倍     

基于微滴式和芯片式数字PCR技术的转基因克螟稻成分的定量检测

以转基因克螟稻品系为研究对象,通过大米内源蔗糖磷酸合成酶基因和转基因克螟稻品系特异性序列的绝对拷贝数分析,建立转基因克螟稻成分的双重数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）定量分析方法。本研究中转基因克螟稻定量体系中最适DNA添加量在10 pg～13 ng之间,模板断裂程度、PCR扩增退火温度等因素对定量结果的影响不大。其定量的绝对灵敏度达1 copies/μL,可在微滴式和芯片式数字PCR平台上准确检测质量分数在0.1%～100%之间的转基因克螟稻成分,尤其是对低于1%的样品,其定量准确性高于传统的实时荧光PCR方法。本研究建立的转基因克螟稻成分定量分析方法适用性较好,可用于转基因水稻规范化与标准化的定量分析。     

Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1

The insect-resistant transgenic rice event TT51-1 (synonym BT63) has been found illicitly planted and distributed for years although it has never been approved for commercial cultivation in any country up to now. The purpose of this study was to establish a detection method that is specific for this transformation event. The event-specific PCR method produces an amplicon of 120 basepairs (bp) based on the revealed 3′ junction sequence with a limit of detection (LOD) and a limit of quantification (LOQ) being approximately 5 and 10 initial template copies, respectively. Two mixed rice samples with known TT51-1 contents were used to verify the developed real-time PCR system, from which the expected results were observed.     

ELISA方法定量检测转基因大豆及其产品的研究

以美国、阿根廷、巴西转基因大豆等为材料,建立了ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4 EP- SPS蛋白的方法,成功检测出美国转基因大豆含量为3.768%、阿根廷转基因大豆含量为2.820%、巴西转基因大含量为1.920%,转基因豆粉、转基因豆粕和中国大豆未检测到CP4 EPSPS蛋白。此方法具有简便、快速、稳定等优点,其检测灵敏度可达到0.0075%,并且稳定性良好,为抗草甘膦转基因大豆中CP4 EPSPS蛋白的定量检测提供了有效的手段。     

TaqMan探针用于转基因食品的荧光定量PCR检测

选择了内源基因大豆植物凝集素 (lectin)、玉米转化酶 (invertase)和外源基因抗草甘膦除草剂的 5 烯醇式丙酮酰莽草酸 3 磷酸合成酶 (cp4epsps)、抗欧洲玉米螟的苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 (cryIAb)的TaqMan探针 ,确定了探针浓度和镁离子浓度等反应条件 ,分别对转基因大豆和转基因玉米系列标准品进行内源基因和外源基因的荧光PCR扩增 ,在PCR反应过程中分别以TET和FAM两种荧光通道信号分别追踪同一样品DNA的内源基因和外源基因的扩增动力学变化 ,并依此绘制了ΔCt值与转基因食品百分比含量之间的标准曲线 ,建立了转基因大豆和转基因玉米的TaqMan -荧光定量PCR检测方法 ,该方法具有探针设计较简便、成本较低的特点 ,初步实现了对转基因食品的定量分析及品种鉴定。     

应用间接ELISA方法定量检测转基因抗虫玉米

应用纯化的Bt1杀虫晶体蛋白质作为标准蛋白和免疫抗原 ,通过抗体 抗原 酶标抗体反应 ,建立了间接酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ,以快速检测转基因抗虫玉米中的Bt1表达蛋白 .用建立的ELISA法对 4种进口玉米实物样品进行了测定 ,实验结果得到了免疫印迹分析的验证 ,并与进口试剂盒方法的定量分析结果相一致     

实时荧光PCR定性定量检测转基因番茄“华番一号"

本实验采用了特异性的引物和探针,对转基因番茄“华番一号”进行实时荧光PCR检测。相对检测灵敏度可达到0.05%。可用于转基因番茄“华番一号”的定性和定量检测。