实时荧光PCR法和国标法检测乳粉中单增李斯特菌的比较研究

目的 提升实验室检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的速度和准确性。方法 依据《GBS4789.30-2016S食品安全国家标准S食品微生物学检验S单核细胞增生李斯特氏菌检验》和能力验证作业指导书对食品中单核细胞增生李斯特氏菌进行检测, 同时利用实时荧光PCR法对能力验证中的2个样品进行快速筛查,采用VITEK2 Compact30全自动微生物鉴定系统鉴定可疑菌落。结果 GB 4789.30国标法和实时荧光PCR快速筛查法检测,结果均为样品CODE:FC02220028单核细胞增生李斯特氏菌阳性, 样品CODE:FC02220098阴性。结论 本实验室参加了中国食品药品质量检定研究院组织的食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证,取得了满意的结果。     

单核细胞增生李斯特氏菌国家标准检验方法的验证与探讨

本文旨在验证、分析和探索食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。方法:依据GB4789.30-2016,首先将实验样品预增菌24 h后,之后,用李斯特氏菌显色培养基和PALCAM琼脂分离培养,将菌株进行染色显微镜观察、动力试验、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试验、李斯特氏菌属鉴定试剂盒、全自动微生物生化鉴定仪等鉴别菌种的方法。结果:实验样品和单核细胞增生李斯特氏菌以及伊氏李斯特氏菌菌落均在李斯特氏菌显色培养基上呈蓝绿色,周围环绕着白色晕圈,实验样本及4种李斯特氏菌标准菌株均是革兰氏阳性,短杆状,不产芽孢和荚膜;生化反应中与葡萄糖、MRVP、麦芽糖、七叶苷、甘露醇等发酵反应结果一致。除了伊氏李斯特氏菌在木糖发酵管中反应呈黄色,为阳性外,其他李斯特氏菌菌株都呈绿色,为阴性。在溶血反应中,英诺克李斯特氏菌在血平板上没有溶血,为阴性,而其他菌株产生透明溶血圈,为阳性;由全自动微生物生化鉴定仪鉴定菌株均为李斯特氏菌属。结论:通过对国家标准测试方法—单增李斯特氏菌的验证,建议通过选择性培养基进行分离后,用木糖、鼠李糖生化反应区分单增李斯特氏菌与其他李斯特氏菌,最后用单增李斯特氏菌生化鉴定试剂盒验证,使检测效率提高同时也提升了检测的准确度。     

不同食品基质中单核细胞增生李斯特氏菌核酸提取方法的比较

比较4类食品基质中单核细胞增生李斯特氏菌核酸提取方法的差异。以不同食品基质中的单核细胞增生李斯特氏菌作为研究对象,选取应用广泛并且原理不同的4种细菌核酸提取方法进行比较,同时结合实时荧光PCR法对各种方法进行实际评估。天根离心柱法核酸提取结果稳定,受不同食品基质的影响较小;Promega沉降法与磁珠法受不同食品基质影响较大,核酸提取结果差异较大;Chelex-100法快速方便,但仅适于纯菌液或菌落的核酸提取。     

单核增生李斯特氏菌检测能力验证结果分析

目的验证本实验室对食品中单增李斯特氏菌的检出能力。方法按照能力验证作业指导书、GB4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌》和SN/T 1870-2016《出口食品中食源性致病菌检测方法实时荧光PCR法》进行检验。首先进行2次前增菌,再按照国标法进行选择分离、纯化、生化鉴定进行检验;同时利用增菌液进行实时荧光PCR方法检验。结果国标法和实时荧光PCR法检验结果均为CODE 40样品检出单增李斯特氏菌,CODE 61样品未检出单增李斯特氏菌。结论组织者对本实验室此次能力验证试验结果评价满意,说明本实验室同时具有传统国标法和实时荧光PCR法检测单增李斯特氏菌的能力。     

冻水产品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验研究

为了确保冻水产品安全,准确检测冻水产品中对单核细胞增生李斯特氏菌,从湛江地区进出口水产品加工厂抽取了1158份冻水产品进行单核细胞增生李斯特氏菌分析,本实验采用了全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法进行了初步筛选,对分离菌株用APIListeria试剂盒进行鉴定。结果显示：1158个样品中有7个样品（0.60%）为单核细胞增生李斯特氏菌阳性,另有4个（0.35%）为L.innocua、L.welschimeri和L.grayi阳性。本试验VidasLMO检测试剂条呈现4个假阳性,经鉴定为李斯特氏菌属中L.innocua、L.welschimeri和L.grayi,表明VidasLMO检测试剂条存在一定的假阳性率。     

乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果分析

摘要：目的 对本实验室单核细胞增生李斯特氏菌检测能力进行验证,以提高或保证实验室能力验证工作中对单核细胞增生李斯特氏菌检测结果的准确性。方法 按照样品的作业指导书开启样品,按照GB 4789.30-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行检验,同时用MALEI-TOF-MS质谱仪对可疑菌进行鉴定,对2种方法结果进行比对。结果 FC02220009样品检出单核细胞增生李斯特氏菌;FC02220080样品未检出单核细胞增生李斯特氏菌。国标方法和MALDI-TOF-MS方法鉴定结果一致。结论 为保证检验结果准确可靠,避免假阴性出现,可多种鉴定手段同时进行。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度(LAMP)检测方法的建立

建立单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度LAMP检测方法。根据单核细胞增生李斯特氏菌hly A基因设计4条特异性引物,采用环介导等温扩增方法 (LAMP)建立单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法。建立的LAMP方法具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,单核细胞增生李斯特氏菌为LAMP阳性,其他菌株均为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的单核细胞增生李斯特氏菌的检测下限为32 CFU/m L,可在60 min内完成扩增反应。用建立的LAMP方法对160份不同食品进行检测,共检出5份LAMP阳性样本,与传统培养方法结果一致。该方法与传统方法相比,可节省大量时间,且对试验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性。     

冻水产品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验研究

对从湛江地区进出口水产品加工厂抽取的1158份冻水产品进行单核细胞增生李斯特氏茵分析,实验采用了全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法进行了初步筛选,对分离菌株用APIListeria试剂盒进行鉴定。经检验,1158个样品中有7个样品（0．60％）为单核细胞增生李斯特氏菌阳性,另有4个（0．35％）为L．innoeua．L．welschimeri和L．grayi阳性。实验中VIDASLM0检测试剂条呈现4个假阳性,经鉴定为李斯特氏菌属中L．innocua、L．welschimeri和L．grayi,表明VidasLM0检测试剂条存在一定的假阳性率。     

基于双启动引物特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的PCR方法

以单核细胞增生李斯特氏菌iap基因为靶基因,利用一新型PCR引物设计方法--双启动引物（Dual-priming oligonucleotide,DPO）,建立了特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的DPO-PCR方法,测试了DPO-PCR方法退火温度不敏感性、特异性及灵敏度,并在实践检测中进行了初步应用。结果显示:该方法检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度为1.51×102CFU/mL;退火温度不敏感性测试中,与常规PCR引物相比,DPO引物在48⁶8℃退火温度范围内均能够高效率地扩增靶基因;特异性测试中,DPO-PCR方法能特异地检测出目标菌,与其他菌株无非特异性扩增反应,比常规PCR方法显示出更强的特异性。实践应用证明,利用DPO-PCR方法对130份样本进行检测,共计检出9份单核细胞增生李斯特氏菌阳性样本,经国标法（GB/T 4789.30-2008）复检,两者检测结果一致,显示出良好的实用性,为单核细胞增生李斯特氏菌的快速准确检测提供了新方法。      

PMA与ddPCR结合检测单核细胞增生李斯特氏菌

将叠氮溴化丙锭(PMA)与微滴数字PCR(dd PCR)技术相结合,检测热灭活背景下单核细胞增生李斯特氏菌活菌。结果表明,PMA终浓度为5.0μg/m L、曝光时间为15 min时,可以有效抑制10~5 CFU/m L的单核细胞增生李斯特氏菌死菌DNA的PCR扩增,不抑制单核细胞增生李斯特氏菌活菌DNA扩增的PMA最高浓度是10.0μg/m L。利用PMA处理死活菌混合液时,PMA-dd PCR可以在死菌存在的条件下,定量检测活菌,降低了"假阳性"结果的出现。检测结果显示:PMA-dd PCR灵敏度是2.0 copy/20μL。利用PMA-dd PCR检测人工污染的鳕鱼样品,最低可检出10~2 CFU/m L的单核细胞增生李斯特氏菌。结果证明PMA-dd PCR方法的精确度、稳定性良好。     

实时定量荧光PCR快速鉴定食品中单核细胞增生李斯特氏菌

目的建立实时定量荧光PCR法(real-time PCR)快速鉴定食品中的单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)。方法选取2016年国家食品风险监测样本134例与模拟灭活LM样本10例,采用GB/T4789.30-2010与real-time PCR方法同步检测单核细胞增生李斯特菌。结果共检测食品134份,包括肉制品、水产品、快餐和即食食品等。共检出8株LM,检出率为5.97%。以GB/T4789.30-2010为金标准判断,real-time PCR方法检测样本中LM的灵敏度与特异度均达到100%。模拟灭活LM样本real-time PCR方法检出率为100%,标准法检出率为0%。结论本方法可以简化实验程序,减少工作量,节约检测试剂,为可能发生的食物中毒尽早提供实验依据。     

恒温荧光核酸检测仪检测2种食源性致病菌的方法验证

目的以传统国标培养法作为参考比对方法,考察恒温荧光核酸检测仪(constant temperature fluorescent nucleic acid detector)检测食品(自然食品和加标食品)中食源性致病菌如阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌的一致性。方法通过对食品中阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌国标培养法和恒温荧光核酸检测仪方法检测结果的比对,考量后者方法的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率和准确度。结果恒温荧光核酸检测仪检测食品中阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度和特异性都是100%,假阴性率为0;假阳性率为0。结论恒温荧光核酸检测仪方法特异性强、准确度高、无一例漏检。     

实时荧光HDA法快速检测单核细胞增生李斯特菌

目的：建立一种用于单核细胞增生李斯特菌的实时荧光赖解旋酶恒温核酸扩增（helicase-dependentisothermal DNA amplification,HDA）快速检测方法。方法：针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计引物对,基于荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）仪的平台,提取单核细胞增生李斯特菌基因组DNA,以此作为模板,优化反应温度、反应时间及引物浓度。利用单核细胞增生李斯特菌及10 株对照菌株,并与实时荧光PCR对比,来验证实时荧光HDA方法的特异性和灵敏度,并初步用于样品检测。结果：实时荧光HDA体系的最适引物浓度为0.075 μmol/L,反应温度及反应时间为65 ℃、80 min（40 个循环）,具有良好的特异性和灵敏度。结论：建立了一种特异性强、灵敏度高的实时荧光HDA检测单核细胞增生李斯特菌的方法。     

LAMP检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

单核细胞增生性李斯特氏菌是一种能够引起人畜共患疾病的食源性致病菌.为了鉴定该菌,以单核细胞增生性李斯特氏菌的李氏溶血素基因(Hly)为靶基因,通过环介导等温扩增技术(LAMP)对该基因进行扩增.共对12株菌进行了LAMP检测,结果表明:单核细胞增生性李斯特氏菌为阳性,其它菌株均为阴性.采用LAMP对单核细胞增生性李斯特氏菌纯培养进行检测,其方法的灵敏度为7.3×101cfu/mL;而利用LAMP检测人工污染的鸡肉中的单核细胞增生性李斯特氏菌,检出限为8.9×101cfu/g.     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测分析

目的:分析食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测结果,以及时发现食品安全隐患,为食品安全监管提供参考依据.方法:严格按照《全国食源性致病菌监测工作手册》中的单核细胞增生李斯特氏菌检验标准,对某市2021年1—12月定期采样的10类常用食品进行单核细胞增生李斯特氏菌检测,分析其阳性检出率.结果:897份10类常用食品中,检出...     

FAPAS乳粉中单核细胞增生李斯特菌能力验证结果分析与讨论

为了提升食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力,本实验室参加了FAPAS分析实验室能力验证机构组织的实验室能力验证,分别运用国标方法、分子生物学方法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法对样品进行检测鉴定。结果表明,M224d02-A样品检出单核细胞增生李斯特氏菌,M224d02-B样品检出英诺克李斯特菌,属于李斯特氏菌属。2个样品检验结果均取得满意结果。     

单核细胞增生李斯特菌在蜂产品中的生存及检测

目的:为了保障蜂产品免受致病性单核细胞增生李斯特菌的威胁,对蜂产品中单核细胞增生李斯特菌进行检测。方法:采用培养和分子生物学的检测方法研究蜂产品中致病性单核细胞增生李斯特菌的污染状况。将高浓度的病原菌人工污染到蜂蜜和蜂王浆中,室温存放一定时间后,在选择性培养基上增菌培养;以毒力基因hly和16sRNA基因为靶序列,建立双重PCR检测病原菌的方法;以5’、3’端标记FAM、TAMRA的hly基因探针进行荧光定量PCR检测。结果:单增李斯特菌在蜂蜜中的存活时间为5d,而在蜂王浆中不能存活。对未经增菌的人工污染蜂产品采用溶菌酶+蛋白酶K的方法提取DNA,同时采用本实验中建立的双重PCR和荧光定量PCR方法检测,蜂蜜中单增李斯特菌含量均为102CFU/mL。采用这两种方法可在8h内完成蜂蜜中单核细胞增生李斯特菌的快速检测。结论:单增李斯特菌能够在蜂蜜中存活数天,几乎不继续繁殖,而在蜂王浆中不能存活。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证

目的通过能力验证提升食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力和实验室质量管理水平。方法依据GB 4789.30-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行检测,利用BAX system Q7全自动病原微生物检测系统对能力验证中的3个样品进行快速筛查,采用VITEK2COMPACT全自动细菌鉴定系统、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和溶血素O基因(hlyA)序列比对分析鉴定可疑菌株。结果编号CODE1和CODE3的样品检出单核细胞增生李斯特氏菌,编号CODE2的样品未检出。结论本实验室参加了中国食品药品检定研究院组织的食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证测试,取得了满意的实验结果。     

环介导等温扩增法检测动植物源性单核细胞增生李斯特氏菌

目的采用环介导等温扩增技术检测动植物源性单核细胞增生李斯特氏菌。方法在北京市范围内各业态餐厅购买600份凉菜样品为研究对象,以单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因为目标基因,设计4条特异性引物,使用环比等温扩增法(loop-to-isothermal amplification, LAMP)创建凉菜中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法并将其应用于鉴定凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌。结果通过细菌分离培养法对600份凉菜进行检测,一共检测分离出37株致病菌菌株,其中包括7株单核细胞增生李斯特氏菌、10株沙门氏菌和20株大肠埃希氏菌,单核细胞增生李斯特氏菌的检出率为1.2%。用LAMP对样品中的菌株进行测定,7株凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌为阳性,其他菌株为阴性。通过LAMP方法检测动植物源性凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌平均检出限为2.2*10 CFU/μL、特异性为100%。动物源性凉菜中的致病菌含量较高。结论环介导等温扩增法具备灵敏、快速、操作简便的特点,适合用于餐饮行业的现场快速检测领域。     

工厂中环境和海产品加工前后的微生物学检验

检测了2个海产品加工厂的环境及加工前后海产品样品的菌落总数(个/cm2,个/g或个/mL)、李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌数(每100cm2,100g或100mL样品的MPN数),其结果如下:2个工厂对应样品的菌落总数及其分布规律相接近,但李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的出现率和数量却相差很大;单核细胞增生李氏菌数都低于或远低于李斯特氏菌,且单核细胞增生李氏菌与李斯特氏菌的数量和分布呈正相关;加工后海产品中的李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌可能来自原料和加工过程;环境中李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌主要来自原料.