抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白表达条件的初步研究

初步研究抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)的表达条件,提高CBLscFv-AP融合蛋白的表达量。采用液体发酵法培养抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)基因工程菌,研究不同宿主菌、初始pH、诱导时期、诱导时间和培养基对CBLscFv-AP融合蛋白表达量的影响以及重组质粒的稳定性。选用E·coliBL21(DE3)pLysS为宿主菌,在初始pH为7·4的LB培养基中培养至A600nm为0·8～0·9时,诱导表达8h,为CBLscFv-AP融合蛋白最佳表达条件。而且重组质粒pBV220-scFv-phoA具有较好的结构稳定性。在该表达条件下,提高了CBLscFv-AP融合蛋白的表达量,为进行大规模发酵生产CBLscFv-AP融合蛋白奠定基础。     

猪脂联素球状结构域gAd蛋白在重组乳酸乳球菌中表达条件的优化

为获得含猪脂联素球状结构域gAd基因的重组乳酸乳球菌的高效表达,对其表达条件和培养基配方进行了优化。首先采用单因素分析法确定重组乳球菌最佳诱导剂浓度、诱导时间点(OD600)和诱导后培养温度,以及培养基中的乳糖浓度、氮源浓度、Na2HPO4浓度和MgSO4浓度对表达量的影响;之后通过正交试验,确定重组乳酸乳球菌的最佳表达条件。结果显示,其最佳诱导剂nisin浓度为30ng/mL、诱导的时间点是OD600≈0.4、诱导后培养温度为25℃;最佳培养基配方是:乳糖添加量为7%、大豆蛋白胨为2.7%、酵母膏为1.3%、Na2HPO4浓度为0.25%、MgSO4浓度为0.02%。优化后,脂联素的表达量为29.4%的总蛋白含量。     

纳豆激酶基因在毕赤酵母中的表达条件研究

通过设计正交试验,对重组Pichiapastrois酵母利用YEPD培养基表达纳豆激酶基因的发酵条件进行了研究,确定最适条件:pH值6·0,培养温度30℃,培养时间36h,诱导时间84h,甲醇添加量1·0%,其中培养温度为主要影响因素。在该条件下进行重组子的培养及诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%。     

重组降血压肽发酵培养基及发酵条件的优化实验研究

以纯化的融合蛋白包涵体表达量为考核指标,对重组降血压肽发酵培养基的组成和发酵条件进行了优化实验研究。以富含疏水性氨基酸的麦胚水解物为基础培养基,通过正交实验,优化得到大肠杆菌BL21-MF3A3制备重组降血压肽的麦胚培养基配方为:酵母粉0.5%、麦胚酶解物C2.0%、葡萄糖0.5%和NaCl0.5%。对发酵过程中的诱导条件进行正交优化实验,得到最佳的诱导条件为诱导温度32℃、诱导起始OD6001.4和诱导时间10h,在此条件下包涵体表达量可达到535mg·L-1。     

重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂发酵条件优化

在获得含高拷贝猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂基因的重组菌株GS115基础上,通过分析甘油加入量、甲醇添加量、山梨醇与甲醇添加比例、诱导初始p H、诱导时间、培养基类型对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kw PMEI1)表达量的影响,优化了摇瓶发酵条件。结果表明:甘油加入量3%(v/v)、甲醇添加量1%(v/v)、山梨醇溶液(100%,w/v)和甲醇(分析纯)以体积比为1∶1的比例添加、p H5.5、在BMMY培养基中诱导表达5 d为最佳条件。该重组蛋白kw PMEI1的表达量最高可达700.302 mg/L。     

重组毕氏酵母表达rhs-TRAIL发酵条件的优化研究

为了提高重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(rhs—TRAIL,114-281)在毕氏酵母工程菌中的表达量,采用1000mL摇瓶培养体系,优化研究了在不同培养基,pH值、表达时间、甲醇浓度等培养条件下的表达情况。经条件优化,最终确定了培养基为完全培养基BMGY／BMMY,甲醇浓度为0．5％,pH为6.0,表达时间为96h。在此优化条件下,目的蛋白表达量可以达到68mg/L。     

细胞穿膜肽与人表皮生长因子在大肠杆菌中的重组融合表达

该研究构建了细胞穿膜肽Pep-1和人表皮生长因子hEGF融合基因（epEGF）的重组表达质粒PGEX-4T-1-epEGF,并成功转化大肠杆菌BL21（DE3）得到重组大肠杆菌株BL21（DE3）/PGEX-4T1-epEGF。通过IPTG诱导发酵,制备重组融合人表皮生长因子蛋白,并初步尝试建立纯化研究,有效实现了人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的可溶性表达。该研究通过发酵条件优化,发现发酵过程中温度、诱导剂浓度、诱导时间、培养基都是影响蛋白表达量的关键因素;温度在20 ℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间8 h、培养基为TB液体培养基,目的蛋白占总蛋白的量达到21.58%,蛋白浓度为0.13 mg/mL。菌体破碎液上清经过GST亲和层析融合蛋白纯度达到66.82%,阴离子交换层析后融合蛋白纯度达到92.57%。该研究成功在大肠杆菌中表达出可溶形式的hEGF,且纯化工艺较简单,为hEGF的进一步开发利用提供了参考。     

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTAPurification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD600 nm为0.6～0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37 ℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6 倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。     

重组人基质金属蛋白酶2(MMP-2)血红素样蛋白表达优化

为确定重组大肠杆菌(BL21(DE3)/PET42a-PEX)最佳表达条件。在单因素实验的基础之上,以目的蛋白PEX表达量为响应值,应用Box-Behnken中心组合设计建立数学模型,进行响应面分析。响应面分析确定的最优因素水平组合为:LB培养基pH为7.50,诱导时菌液OD600为0.60,IPTG诱导浓度为0.60mmol/L,诱导培养时间为5.0h。对此工艺条件进行验证得到目的蛋白PEX表达量为20.98mg/L。结果显示,优化了基因重组大肠杆菌表达人PEX的条件,为实现基因重组原核工程菌发酵法制备重组PEX奠定了基础。     

表达藤黄微球菌过氧化氢酶基因的工程大肠杆菌发酵条件优化

目的优化表达重组藤黄微球菌(M.luteus)过氧化氢酶基因工程菌的发酵条件。方法以生物量和目标蛋白表达量为判断标准,利用单因子试验和正交试验在摇瓶水平优化初始pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间等影响工程菌发酵制备藤黄微球菌过氧化氢酶的发酵条件。结果最佳发酵工艺参数:培养基初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,装液量75 mL,接种量6%,培养温度37℃,诱导表达时间5 h。蛋白表达量比优化前提高近30%,重组蛋白经Ni-NTA纯化和透析后,酶活性为166.0 U/(mg.protein),以实验条件相同野生菌酶活100.0 U/(mg.protein)为对照,重组酶的酶活性提高66%。结论工艺优化后,酶表达量及酶活性均显著提高。     

基于红曲高产莫纳可林K的固态发酵工艺条件优化

利用响应面法优化红曲固态发酵产莫纳可林K的工艺条件。在采用变温发酵,发酵时间固定的条件下,单因素试验研究接种量、装料量、玉米粉添加量和蛋白胨添加量等4个因素对红曲固态发酵莫纳可林K产量的影响。在此基础上,应用Design-Expert软件建立数学模型,进行四因素三水平的响应面分析。结果表明,红曲固态发酵高产莫纳可林K工艺条件为接种量17.50%,装料量32.95 g/250 mL、玉米粉添加量3.80%和蛋白胨添加量2.37%。此条件下进行验证试验,莫纳可林K产量为11.25 mg/g,与回归方程预测值无显著差异,说明该法优化红曲固态发酵过程中莫纳可林K的产量可行。     

高产Monacolin K的青稞功能红曲发酵工艺优化研究

选用青稞为原料,在固态发酵条件下,研究青稞接种从毛红曲霉（Monascus pilosus）后发酵过程中不同因素对Monacolin K产量的影响。对不同培养基配方及发酵条件等进行单因素试验优化,并以发酵温度、接种量和初始pH值为影响因素,确定产Monacolin K的青稞功能红曲的最优发酵工艺条件。结果表明,以pH 4.0的水浸泡至无白心后蒸煮20 min的青稞米为基础培养基,添加0.6%蛋白胨、0.3%酵母提取物和0.3%磷酸二氢钾,装料量160 g/500 mL,接种10%从毛红曲菌液体菌种,变温发酵,32 ℃发酵2 d后降温至25 ℃发酵21 d。此优化条件下Monacolin K产量可达1.52%。     

一株产吲哚乙酸耐盐促生菌的分离、鉴定及发酵条件优化

从碱蓬根际土壤中分离筛选获得一株能产吲哚乙酸（IAA）的促生菌株BG-5,对该菌株进行了16S rDNA序列分析。以IAA的产量作为评价指标,利用单因素试验及响应面分析法对发酵条件及培养基成分进行优化。结果表明,BG-5菌株被鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）,最佳培养条件为装液量30 mL/250 mL、初始pH值为8、培养温度37 ℃;优化后的培养基成分为酵母提取物7.3 g/L,胰蛋白胨8.8 g/L,七水硫酸镁7.2 g/L;在此最优条件下,BG-5菌株的吲哚乙酸产量为87.86 μg/mL,约为优化前的2倍。     

重组大肠杆菌产谷氨酰胺转氨酶培养基及发酵条件优化

对已构建好的表达谷氨酰胺转氨酶的大肠杆菌Rosetta DE3的摇瓶培养条件及发酵条件进行优化,所获优化培养基配方为葡萄糖4.0g/L,酵母膏3.0g/L,NH4Cl 4.0g/L,Na2HPO42.0g/L,K2HPO41.0g/L,MgSO4.7H2O 1.0g/L,NaCl 3.0g/L。得菌株发酵培养的最佳优化条件为装液量为25mL,接种量为5%,加IPTG浓度为0.6mmol/L,诱导时间为4h。     

莓实假单胞菌产低温胆固醇酯酶发酵条件优化

为了提高莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）Q-06产低温胆固醇酯酶的能力,在单因素试验基础上,结合Plackett-Burman设计和最陡爬坡试验确定影响酶活的3个显著影响因子为葡萄糖添加量、摇瓶装液量、培养温度,确定最优发酵培养基配方为葡萄糖3.0%,酵母粉1.3%,（NH4）2SO4 0.010%,MgSO4·7H2O 0.050%,KH2PO4 0.400%,运用Design-Expert软件Box-Behnken试验设计对P. fragi Q-06发酵产生甾醇酯酶的培养基条件和发酵条件进行优化。结果表明,最适发酵条件为温度28 ℃,转速180 r/min,接种量4%,初始pH 7.5,装液量80 mL/250 mL。在此最佳条件下,甾醇酯酶酶活由优化前360.00 U/L提高至479.64 U/L,是优化前的1.33倍。海洋微生物发酵甾醇酯酶工业化生产有望创造可观的经济效益,具有潜在的研究开发价值。     

安全高效红曲米工程化生产技术开发

为了实现高色价低橘霉素红曲米的工程化生产,通过单因素试验和正交试验讨论了培养基pH值、培养时间、培养基装量、培养温度、接种量和养花温度对红曲米色价和橘霉素含量的影响,然后进行了3 T发酵罐制种试验、中试生产试验和工程化生产试验。结果表明,最佳培养基pH值为6.5、培养时间为8 d、培养基装量为500 g/浅盘、培养温度为32 ℃、接种量为9%、养花温度为40 ℃。3 T发酵罐制种试验结果表明,在发酵30 h左右,菌丝丰富,含量达到30 g/L以上,种子液黏稠、呈深红色,pH 5.0～5.5。在中试生产试验和工程化生产试验中,红曲米的产率都达到了40%以上,色价均在5 000 U/g左右,橘霉素含量都≤42 μg/kg。     

Effect of pre-fermentation on the production of cutinase by a recombinant Saccharomyces cerevisiae

The importance of controlling the expression of heterologous cutinase in a recombinant Saccharomyces cerevisiae SU50 strain was investigated. Maximum specific growth rate and the biomass yield increased 1.91 and 1.16 fold, respectively, when cutinase production was induced by galactose in a pre-fermentation step. However, only 19% of specific cell activity was obtained in comparison to other fermentations following a pre-fermentation step without induction of cutinase expression. Thus, the pre-fermentation step was performed using a selective medium not containing galactose, and the fermentation was performed with a cheaper and complex non-selective medium containing galactose. Under these conditions, and with the aim of maximising the specific cutinase activity, a pre-fermentation with low volume and high density of viable cells must be used. However, due to the low pre-fermentation volume, low yeast cell concentrations and low specific cell activities were obtained after 96 h of fermentation. Otherwise, when the aim was to maximise cutinase yield and productivity, a pre-fermentation volume of 10% (v/v) in relation to fermentation and in the exponential growth phase with a cell concentration between 1.1 and 1.8 g dcw/l should be used. A higher pre-fermentation volume, such as 20% (v/v), would still be economical in the case of a pre-fermentation with low cell density or low cell viability.     

响应面法优化异常毕赤酵母（Pichia anomala）0732-1抑菌产物发酵条件

以异常毕赤酵母（Pichia anomala）0732-1为试材,对其抑菌产物发酵条件进行了响应面优化,并对其产物进行抑菌效果测定。利用Plackett-Burman试验,分析了5种因素对其产物抑菌的影响,确定培养液初始pH值、温度、装样量为影响其抑菌的重要因素。经最陡爬坡试验确定各因素峰值后,利用Box-Behnken试验设计和响应面方法（RSM）分析得到最优发酵条件为培养液初始pH 9.4、培养温度25 ℃、装样量61 mL/150 mL。在此优化条件下,抑菌圈直径为17.9 mm,较优化前提高了32.6%。     

纳豆芽孢杆菌TK-2产γ-聚谷氨酸发酵工艺优化

以γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的产量为评价指标,在单因素试验基础上,利用正交试验法对纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）TK-2产γ-PGA的发酵工艺进行优化,并对其发酵产物进行高效液相色谱（HPLC）分析。结果表明,最佳培养基配方是葡萄糖2.5%,蛋白胨2.5%,味精2%,pH值7.5;最佳发酵条件是装液量70 mL/250 mL,接种量2%,发酵温度37 ℃,转速140 r/min,在此优化条件下进行验证试验,γ-PGA产量为11.48 g/L,提高了57.2%。HPLC分析表明,γ-PGA是谷氨酸的一种聚合物,其水解产物只有一种氨基酸。