人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

猪干扰素α基因的克隆与真核表达

目的克隆猪干扰素α(IFNα)基因,并在毕赤酵母中进行表达。方法用植物血凝素诱导猪外周血中的淋巴细胞,Trizol试剂提取总RNA,经RT-PCR扩增猪IFNα基因,将其克隆至pPIC9K载体中,构建重组真核表达质粒pPIC9K-IFNα,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,电转化至毕赤酵母GS115中。筛选阳性菌株,经甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果RT-PCR扩增获得521bp的猪IFNα基因;所构建的重组表达质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为19000,可溶性蛋白约占菌体总蛋白的13%;该蛋白能与相应抗体产生特异免疫反应。结论已成功克隆并在毕赤酵母中表达了猪IFNα基因,为进一步研究其生物学性状奠定了基础。     

人BimS蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人BimS基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人BimS基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到327bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-BimS经双酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约37000,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后纯度可达93%。结论已成功克隆并原核表达了人BimS基因,得到纯度较高的BimS蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

人Bid蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人Bid基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人Bid基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到588bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid经双酶切鉴定和测序表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约48000,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度可达97%。结论已成功克隆并原核表达了人Bid基因,得到纯度较高的Bid蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

重组人BAFF_(134～285)的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的克隆人TNF家族的B细胞激活因子(BcellactivatingfactortotheTNFfamily,BAFF)胞外区cDNA,并进行高效表达和纯化。方法提取人新鲜扁桃体组织总RNA,经RTPCR扩增编码人BAFF胞外区134～285氨基酸残基cDNA,经序列测定后,克隆至pQE80L载体中,并转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达及Ni2+NTA柱层析纯化目的蛋白,最后经SDSPAGE和Westernblot检测。结果RTPCR扩增得到了459bp的cDNA片段,序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF134～285的cDNA序列一致,SDSPAGE及Westernblot证实表达蛋白确实为6×HisBAFF134～285融合蛋白,并存在于包涵体中。结论利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF134285,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

人IL-23R胞内区基因的克隆与原核表达

目的克隆人IL-23R(hIL-23R)胞内区基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法通过PCR获得hIL-23R基因的胞内区片段,克隆至载体pGEX-4T-1中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(I),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果hIL-23R胞内区基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约760bp的目的片段。重组原核表达质粒经双酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为55000,在低温(20℃)、低IPTG浓度(0.5mmol/L)诱导条件下能以可溶形式表达,可溶性蛋白的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的16.1%,且可被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功克隆了hIL-23R胞内区基因,并在大肠杆菌中表达了可溶性的GST融合蛋白。     

人sΔBAFF的高效原核表达及纯化

目的克隆TNF家族B细胞激活因子(BcellactivatingfactortotheTNFfamily,BAFF)胞外区134~285(sBAFF134-285)氨基酸残基段缺失突变体(sΔBAFF)的cDNA,并进行表达及纯化。方法以构建的重组质粒pUC19/sBAFF为模板,采用一步反向PCR法,扩增缺失编码sBAFF的142~160位氨基酸的核苷酸序列。经测序证实后,克隆入原核表达载体pQE-80L。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot检测表达产物,Ni2+-NTA柱层析纯化目的蛋白。结果经一步反向PCR扩增后得到401bp的DNA片段,该片段序列与GenBank报道的编码人ΔBAFF的胞外区(sΔBAFF)cDNA序列一致。含sΔBAFF的表达载体在大肠杆菌中可表达出相对分子质量为18000的蛋白质并以包涵体的形式存在,经Ni2+-NTA柱层析纯化后得到高纯度的目的蛋白。结论已成功地制备出人sΔBAFF蛋白,为其功能的研究创造了条件。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

目的克隆猪血清白蛋白(PSA)基因,并在毕赤酵母中分泌表达。方法Trizol法提取新鲜猪肝组织总RNA,经RT-PCR扩增PSA全长cDNA,克隆至酵母分泌型表达载体pPICZaC,构建重组表达质粒pPICZaC-PSA,电转化至毕赤酵母X33,甲醇诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒pPICZaC-PSA经双酶切及测序鉴定正确,表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约69500处可见特异条带,表达量为菌体总蛋白的29.5%,紫外吸收法测定蛋白含量为0.06mg/ml,并可与PSA多抗发生特异性反应。结论已成功克隆了PSA基因,并在毕赤酵母中获得表达。     

牛Ⅱ型链球菌van B2蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化牛Ⅱ型链球菌(Streptococcus bovis biotypeⅡ)van B2蛋白。方法采用PCR法从牛Ⅱ型链球菌基因组DNA中扩增van B2基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-van B2,转化大肠杆菌Rossata(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果 PCR扩增获得597 bp的van B2基因片段;重组表达质粒pET-28a-van B2经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组van B2蛋白相对分子质量约为29 000,主要以可溶性形式表达;纯化的重组蛋白纯度为70%,可被小鼠抗牛链球菌血清Ⅱ型多克隆抗体特异性识别。结论原核表达并纯化了牛Ⅱ型链球菌van B2蛋白,为van B2基因的耐药性研究奠定了物质基础。     

鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的原核表达与抗原性分析

目的表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)弱毒株VP2蛋白并检测其抗原活性。方法以IBDV强毒致弱株Gt株基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法扩增VP2基因,并将其克隆入pUC18载体,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET30a中,并经酶切、PCR、测序鉴定,阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)菌,经IPTG诱导后,表达产物用SDS-PAGE及Westernblot检测。结果阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)后,经诱导表达了目的蛋白,表达量占菌体总蛋白的15%。Westernblot检测表达蛋白可与IBDV阳性血清发生反应,而与阴性对照血清不发生反应。结论已成功表达了鸡传染性法氏囊病毒弱毒株VP2蛋白,且具有良好的抗原性。     

人HSP70与MAGE-4表位基因原核表达载体的构建及表达

目的构建热休克蛋白70(HSP70)与黑色素瘤抗原-4(MAGE-4)抗原表位基因的原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法在热应激条件下,用PCR法从结肠腺癌细胞获取HSP70基因。在线用蛋白质二级结构预测软件分析MAGE-4抗原表位,PCR获取MAGE-4抗原特征表位基因。将二者分别克隆入pGEM-Teasy载体,酶切鉴定后,将HSP70基因亚克隆入pET28a原核表达载体,再将MAGE-4基因克隆入HSP70基因的下游,构建重组质粒pET28a-HSP70-MAGE-4。转化大肠杆菌,IPTG诱导表达并鉴定。结果所构建的HSP70与MAGE-4抗原表位基因表达载体pET28a-HSP70-MAGE-4,经PCR及DNA测序结果表明构建正确。SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带。结论已成功构建了人HSP70与MAGE-4抗原表位基因的原核表达载体,为疫苗研究提供了依据。     

西方马脑炎病毒E2基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达西方马脑炎病毒(Western equine encephalomyelitis virus,WEEV)E2基因。方法采用PCR法从重组质粒pVL1393-C-E中扩增E2基因,插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-E2,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-30a(+)-E2经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为52 900,诱导6 h目的蛋白的表达量较高,约占菌体总蛋白的23.5%,重组蛋白主要以包涵体形式存在,可与鼠源His单克隆抗体特异性结合。结论克隆并原核表达了WEEV E2基因,为E2蛋白免疫原性及WEEV亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

重组猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的原核表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行分析。方法通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF2编码382~674位氨基酸序列的基因片段,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-293表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定。结果成功扩增到904bp的目的基因。重组载体pET28a-293经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确。SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量与预期相符,表达量可占菌体总蛋白的66.15%。Western blot分析表明目的蛋白具有较好的反应原性。ELISA试验证实目的蛋白能与阳性猪源和标准HEV血清发生反应。结论已成功构建了猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的pET28a-293原核表达载体,并得到了有效表达,为进一步建立猪源戊型肝炎的诊断方法奠定基础。     

人颗粒酶B的表达及抗原性初步分析

目的在原核系统表达人颗粒酶B(GrB)酶原型及活性型基因,并分析表达产物的抗原性。方法从人外周血淋巴细胞中抽提RNA,用RT-PCR方法扩增人颗粒酶B序列,将其克隆至pGEX-5x-1表达质粒,与GST进行融合表达,用SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行分析。结果所克隆的GrB序列与已报道的从人体分离出的GrB完全一致。酶原型和活性型GrB与GST的融合蛋白以包涵体的形式表达,其大小与预期结果一致,并能与GrB特异性抗体发生结合反应。结论已成功构建了GrB原核表达系统,酶原型及活性型GrB均具有抗原性。     

日本血吸虫双表膜抗原融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建编码日本血吸虫表膜蛋白SjTsp2与Sj29融合基因的原核表达质粒,并表达重组蛋白。方法利用基因SOEing PCR技术得到SjTsp2与Sj29融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果序列分析显示,融合基因与两个目的基因的同源性达100%;SDS-PAGE显示表达的重组蛋白相对分子质量为43000,表达量占菌体总蛋白的20%以上;Western blot显示其分别能与SjTsp2和Sj29蛋白的单克隆抗体结合。结论已成功构建了SjTsp2与Sj29融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为研制血吸虫病疫苗提供了材料。     

金黄葡萄球菌ClfA活性基因的克隆及原核表达

目的克隆金黄葡萄球菌表面蛋白凝集因子A(ClfA)活性基因,并进行原核表达。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ClfA(221-550)活性基因,克隆入载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a-ClfA(221-550),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果PCR扩增出987bp的目的基因片段,重组表达质粒经双酶切证明构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约36000处可见目的条带,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的36.76%,且具有良好的反应原性。结论已成功克隆了金黄葡萄球菌ClfA活性基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了目的蛋白。     

大肠癌相关基因PGDH原核表达质粒的构建及表达

目的构建15-羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达PGDH蛋白。方法以人正常大肠黏膜组织总RNA为模板,利用RT-PCR扩增PGDH基因的编码序列,克隆入原核表达载体pBV220,转化E.coliDH5α,经温控诱导表达,并经Ni2+-NTA亲和层析纯化,目的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果重组质粒pBV220-PGDH-His6经PCR及酶切鉴定,证明质粒构建正确。经温控诱导后,可表达出相对分子质量约为29 000的PGDH-His6蛋白,表达产物以包涵体形式存在,3 h诱导表达量最高,约占菌体总蛋白的30%。Western blot验证了表达蛋白的特异性。纯化后目的蛋白纯度大于95%。结论已成功构建PGDH原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了PGDH蛋白。     

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。