pH值对运动发酵单胞菌葡萄糖代谢酶活性影响的研究

以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)ATCC31821为模式菌株,研究pH值条件对其葡萄糖代谢关键酶活力的影响.结果表明:发酵液pH5.5时,胞内乙醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力较高,而异柠檬酸脱氢酶活性较低,能促进乙醇的生成;pH 5.0时,苹果酸脱氧酶的酶活力较低,使糖酵解反应向另一个方向发生偏移,促进乙醇的形成.pH 4.0～6.5时,丙酮酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活力水平相差不大,说明pH值对这2种酶的活性影响甚微.因此,pH5.0～5.5,代谢途径(如糖酵解途径、ED途径等)中的胞内代谢酶活性增强,有利于乙醇的产生.     

不同代数啤酒酵母对胞内代谢关键酶活性的影响

对不同代数啤酒酵母在丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活性特征方面的差异进行了比较分析,发现酵母在不断传代过程中,胞内代谢关键酶的活性均呈现一定变化,而丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和乙醇脱氢酶变化最为明显,并且与酵母活力有着紧密的联系,当3种酶活性高时,酵母活力旺盛,代谢物质的量较为协调.     

渗透压对酿酒酵母胞内代谢关键酶活性的影响

对耐高渗酵母与普通酿酒酵母在丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活性特征的差异进行比较分析,建立酶活力测定方法.发现耐高渗酵母在高渗环境的诱导下,其EMP途径、磷酸戊糖途径的关键酶活力都高于普通酿酒酵母.耐高渗酵母具有高活力的乙醇脱氢酶,其能高效地将丙酮酸转化成乙醇.并且三羧酸循环中的关键酶异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性也得到加强.这些酶活力的增强维持了耐高渗酵母在高渗、高酒精环境下的生长需要与能量代谢的平衡.     

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶在产油细菌浑浊红球菌PD630脂质积累中的作用

产油微生物脂质合成的过程已基本清晰:乙酰辅酶A和还原力NADPH在脂肪酸合酶(FAS)的作用下合成脂肪酸。产油微生物菌体内主要有苹果酸酶(ME)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)和异柠檬酸脱氢酶(ICDH)为其脂质合成提供所需还原力NADPH。为了研究6PGDH在浑浊红球菌PD630(Rhodococcus opacus PD630)脂质积累中的作用,作者将编码氧化磷酸戊糖路径(oxPPP)中6PGDH的基因gnd在R. opacus PD630中过表达。结果表明,与对照菌株相比较,过表达gnd的重组菌株总脂肪酸含量提高了20%～30%,且6PGDH酶活力和gnd的转录水平也显著提高。由此可见,6PGDH在R. opacus PD630脂质合成中具有重要的作用,能为其提供所需的还原力NADPH,以促进其脂质的积累。     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及高效表达

扩增了枯草芽孢杆菌中的葡萄糖脱氢酶基因（gdh）,构建了诱导型表达载体pET-gdh,导入E.coliBL21（DE3）后获得了高效表达葡萄糖脱氢酶基因的重组菌BL21/pET-gdh。经过诱导时间、诱导温度参数的优化,IPTG诱导后重组菌BL21/pET-gdh的葡萄糖脱氢酶比酶活高达9.65 U/mg蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,重组蛋白质表达量占全菌胞内可溶性蛋白的53%,实现了葡萄糖脱氢酶基因的高效表达,为氧化还原酶催化系统提供高效率的NADP＋与NADPH循环奠定了基础。     

耐Mn~(2+)高产柠檬酸菌株的选育及其特性分析

诱变选育耐锰离子(Mn2+)的高产柠檬酸菌株,并研究了突变株的特性。采用紫外和亚硝基胍复合诱变,以含不同浓度Mn2+的培养基进行筛选,同时考察了不同浓度Mn2+对突变株柠檬酸发酵、关键酶酶活力及呼吸途径的影响。在以葡萄糖为唯一碳源进行摇瓶发酵时,突变株柠檬酸产量比野生菌株提高了92.4%,突变株UV-141对高浓度Mn2+有一定的耐受性,且Mn2+对其发酵生产柠檬酸有促进作用,与不添加Mn2+时相比,添加300 mg/L Mn2+时,柠檬酸产量及葡萄糖最大比消耗速率分别提高了107%和16.7%;乌头酸酶最高酶活下降了15.8%,NAD+-(NADP+-)异柠檬酸脱氢酶对Mn2+不敏感且在整个发酵过程中始终处于较低水平,有利于柠檬酸的积累;当侧系呼吸链(AOX)受到水杨基氧肟酸(SHAM)抑制时柠檬酸产量显著下降,而添加Mn2+则能够削弱其对柠檬酸产量的影响。突变株柠檬酸产量明显高于野生菌株,Mn2+能促进突变株葡萄糖代谢加快、乌头酸酶酶活下降,同时能削弱SHAM对AOX途径的影响,从而促进柠檬酸的大量积累。     

阻断辅因子NADPH合成对谷氨酸棒杆菌生长及产物合成的影响

该文通过敲除谷氨酸棒杆菌(C. glutamicum)中参与NADPH合成的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(zwf)、苹果酸酶基因(malE),并将自身NADP~+-依赖型异柠檬酸脱氢酶基因(icd_(Cg))替换为变形链球菌(Streptococcus mutans) NAD~+-依赖型异柠檬酸脱氢酶基因(icd_(Sm)),构建重组菌株C. glutamicum LYSΔzwfΔmal EΔicd_(Cg)::icd_(Sm),并研究阻断NADPH合成途径对胞内腺嘌呤核苷酸、吡啶核苷酸、细胞生长、葡萄糖消耗速率、产物合成的影响。与出发菌C. glutamicum LYS相比,重组菌胞内NADH提高38. 58%,NADH/NAD~+提高53. 84%。而NADPH降低89. 51%,明显低于出发菌,NADPH/NADP~+降低93. 13%。摇瓶结果表明,重组菌葡萄糖代谢能力明显减弱,生长也相对缓慢,菌体量降低4. 36%。同时L-赖氨酸产量降低87. 69%,而在胞内积累了大量副产物,如丙酮酸、乳酸等。为进一步研究NADPH调控L-赖氨酸产生菌胞内微环境的生理机制提供了研究基础。     

基于乙醇在线测量的DO-Stat甘油流加策略稳定重组毕赤酵母生产猪α干扰素的性能

重组毕赤酵母发酵生产猪!干扰素(pIFN-!)过程性能不稳定,高密度细胞培养阶段的性能指标直接影响到甲醇诱导期的猪!干扰素表达水平。测定分析甲醇代谢关键酶基因的转录水平以及酶活,发现甘油流加培养末期乙醇的大量(超过6 g/L)和长期积累(超过4h)不可逆转地抑制醇氧化酶(AOX)的启动,是导致猪!干扰素无法正常表达、发酵生产不稳定的主要原因。为此,提出了基于乙醇在线测量的改良型甘油流加控制策略,该策略可以在保证细胞快速生长的同时、将乙醇浓度有效控制在2 g/L以下的水平。与传统DO-Stat甘油流加策略(策略A)相比较,改良型甘油流加策略(策略B)可以强化猪!干扰素的诱导表达性能、确保其发酵生产的稳定:1)相同诱导条件下(甲醇/山梨醇培养基流加体积比1∶1),两个发酵批次大猪!干扰素浓度比使用策略A时优批次的大值分别提高75.5%和29.8%;2)在合理改变诱导条件时(甲醇/山梨醇培养基流加体积比4∶1),大猪!干扰素浓度仍比使用策略A时优批次的大值提高38.9%。     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的Candida tropicalis过量表达及其对木糖醇合成代谢的影响

研究葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因g6pd过量表达对Candida tropicalis木糖醇生物合成代谢的影响。克隆Candidatropicalis CT16的g6pd基因,并将其与表达载体pYES-pgk重组连接,构建重组载体pYES-pgk-g6pd,LiAc/ssDNA/PEG方法转化导入C. tropicalis CT16,筛选阳性转化子,实现g6pd基因的过量表达。结果表明：发酵62 h,阳性转化子C. tropicalis SYG5的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力提高了300%,发酵液中木糖醇质量浓度达到79.90 g/L,较野生型对照菌株的木糖醇产量提高了12.41%,木糖醇产率提高了44.94%。因此,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在C. tropicalis木糖醇的合成代谢途径中发挥重要作用,增强g6pd基因的表达,可以明显提高菌体NADPH供应量和还原力,有利于木糖醇的生物合成。     

甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌Rosetta中的高效表达

甲酸脱氢酶是氧化还原酶辅酶NAD(P)~+和NAD(P)H再生循环体系中的关键酶。实验中,用PCR方法扩增了假丝酵母Candida boidinii中甲酸脱氢酶基因(fdh),分别构建了诱导型表达载体pUC-dh和pET- fdh,以E.coli Rosetta为表达宿主,获得了能够高效表达甲酸脱氢酶的重组菌。经诱导后重组菌Rosetta/pET- fdh的FDH比酶活为0.399U/mg(蛋白),Rosetta/pUC-fdh的FDH比酶活为0.163U/mg(蛋白)。经SDS- PAGE分析,Rosetta/pET-fdh和Rosetta/pUC-fdh表达的FDH蛋白分别占菌体可溶性总蛋白的17%和10%,实现了fdh基因在Rosetta中的高效表达。研究中所构建的重组菌为氧化还原反应中的辅酶再生奠定了良好的基础。     

Multiplicity of mechanisms of carbon catabolite repression involved in the synthesis of alcohol oxidase in the methylotrophic yeast Pichia pinus

The effect of various carbon compounds on the synthesis of alcohol oxidase in a medium with methanol was studied in the wild type strain of Pichia pinus as well as in gcr1 and ecr1 mutants defective in glucose and ethanol repression of methanol metabolic enzymes, respectively. Compounds repressing the synthesis of alcohol oxidase in the wild type strain were divided into four groups. Repression of alcohol oxidase by compounds of the first group (glucose, fructose, mannose, galactose, L -sorbose and xylose) was impaired only in the gcr1 mutant and that by compounds of the second group (ethanol, acetate, 2-oxoglutarate and erythritol) only in the ecr1 mutant. Repression by compounds of the third group (malate, dihydroxyacetone) was not impaired in both these regulatory mutants and that by compounds of the fourth group (succinate, fumarate, L -arabinose, sorbitol, salicin, xylitol and cellobiose) was partially reduced in both gcr1 and ecr1 strains. Mutation gcr1 causes a significant decrease in phosphofructokinase activity. It also led to a six- to seven-fold increase in intracellular pools of glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate and to a two-fold decrase in the intracellular pool of fructose-1,6-bisphosphate. In ecr1 strains, a decrese in 2-oxoglutarate dehydrogenase activity accompanied by an increae in activities of NAD- and NADP-dependent isocitrate dehydrogenases and NAD- and NADP-dependent glutamate dehydrogenases was demonstrated. The intracellular pool of 2-oxoglutarate was increased 2·5-fold in ecr1 strains. Genes GCR1 and ECR1 are not linked. The mechanisms of catabolite repression of alcohol oxidase in methylotrophic yeasts are discussed.     

温度对Zymomonas mobilis糖代谢关键酶活力和代谢流量的影响

以运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ATCC31821为模式菌株,研究不同温度条件对其葡萄糖代谢关键酶活力的影响。采用全自动发酵罐,在整个发酵过程中通过充入氮气调节发酵液的溶氧量（DO）=0%,添加0·5mol/LNaOH溶液控制pH=5·5,发酵温度分别控制为25、30、35、40℃,发酵24h,测定其糖代谢网络中ED、HMP、TCA等途径的关键酶活力和代谢物成分。结果表明,在发酵温度为30～35℃时,乙醇脱氢酶（ADH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）、丙酮酸脱羧酶（PDC）、葡萄糖激酶（GK）、丙酮酸激酶（PK）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GD-3-PDH）的活力较高,菌体的ED途径代谢活跃,碳素流量增加,乙醇生产量和糖转化率较高,而TCA途径的苹果酸脱氢酶（MDH）和异柠檬酸脱氢酶（ICDH）等活力较低,进入TCA途径的碳素流量明显减少;发酵温度为25、40℃时,TCA途径的酶活力升高,ED途径的酶活力减弱,生成乙醇的代谢流量减少,因此温度是Z·mobilis发酵过程中调控菌体细胞生长和糖代谢的一个重要因素。      

镁、钼对野油菜黄单胞菌代谢关键酶的影响

野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)是一种利用碳水化合物为主要底物发酵产生酸性胞外杂多糖黄原胶的革兰氏阴性菌。本实验研究了通过添加不同浓度的Mg2+、MoO2-对野油菜黄单胞菌代谢过程中关键酶:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,丙酮酸激酶在不同发酵时期的活性变化。结果表明,Mg2+添加量为1ml即在发酵液中为0.5g/50ml时葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性明显提高,MoO2-在发酵液中浓度为0.20g/50ml时丙酮酸激酶活性提高,表明适量的镁、钼对上述酶活性有调控作用。     

影响香蕉酒中甲醇和高级醇形成的主要因素分析

利用气相色谱方法检测香蕉酒中甲醇和高级醇,并运用单因素试验和主成分分析法研究了酶解和发酵工艺条件对香蕉酒中甲醇和高级醇含量的影响。甲醇和高级醇总量在不同工艺条件下的差别分别为：半熟香蕉中甲醇和高级醇类的含量分别比全熟香蕉高9.5%和22.7%;未经酶解比酶解低57.0%和20.6%;起始发酵糖度20%比22%的工艺高10.1%和19.0%;带渣发酵比液态发酵分别低8.5%和高16.8%;甲醇含量在发酵温度32 ℃时达到最高193.60 mg/L,高级醇含量在28 ℃时达到最高584.00 mg/L。主成分分析结果表明,香蕉酶解工艺的特征醇正丙醇、异戊醇和甲醇,与酶解工艺密切相关。香蕉酒发酵工艺的特征醇类是异戊醇、正丙醇。     

溶解氧控制对枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响

在50 L的生物反应器中,通过控制溶解氧水平为5%、10%、20%、30%四个水平考察枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响,发现该菌株生长的溶解氧浓度在10%～20%。并通过发酵过程中菌株的生长情况、菌体摄氧率和发酵产苷进行相关分析。结果表明,在发酵过程中DO水平控制在10%～20%时腺苷积累量高,发酵液中DO水平为5%和30%均不利于发酵液中的腺苷积累。通过对发酵终点丙酮酸的检测,发现枯草芽孢杆菌在低溶氧状态下比高溶氧状态下积累更多的丙酮酸。在此基础上,提出两阶段DO控制策略,最终腺苷积累量达到20.1 g/L。     

Some biochemical changes associated with post-harvest storage of white yam (Dioscorea rotundata) tubers

Healthy Dioscorea rotundata tubers were kept for 8 months under local storage conditions and periodically analysed for the activity of some enzymes of carbohydrate metabolism as well as for the concentrations of key tuber metabolites. Except for polyphenol oxidase, all the other enzymes monitored showed low and maximum activities before and at onset of sprouting, respectively. The activities of these enzymes after sprouting remained higher than those in the pre-sprouting period. Hexokinase, alcohol dehydrogenase and phosphorylase showed an approximately 2-fold increase in activity at sprouting while glucose-6-phosphate dehydrogenase showed a more than 3-fold increase in activity. Polyphenol oxidase (PPO) activity and starch content decreased steadily with storage with PPO activity decreasing to one-half by the end of storage. L-ascorbate, total polyphenols, carotenoids and lipids increased with storage and peaked at sprouting.     

源于 GAP 启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用非常广泛的外源基因真核表达系统。与源于醇氧化酶启动子(pAOX1)的诱导型表达系统相比, 源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母组成型表达系统在表达外源蛋白时不需使用甲醇, 表达时间短, 并且在高密度发酵时采用连续发酵模式, 因此成为近年研究的热点。本文分别从pGAP表达载体的构建、碳源、基因拷贝数、信号序列、高密度发酵等方面对该表达系统进行了综述, 以期为其在蛋白生产中的深入研究和应用提供参考。     

Flavonoids from Garcinia cambogia lower lipid levels in hypercholesterolemic rats

Administration of flavonoids from Garcinia cambogia, at a dose of 1 mg 100 g⁻¹ body weight day⁻¹, significantly lowered lipid levels in rats fed normal and cholesterol-containing diets. β-Hydroxy β-methyl glutaryl coenzyme A reductase showed significant reduction in normocholesterolemic rats. Activities of glucose-6-phosphate dehydrogenase and isocitrate dehydrogenase were reduced significantly. Highly stimulated activities of the enzymes lipoprotein lipase and plasma lecithin cholesterol acyl transferase were noted in flavonoid-administered animals. Hepatic and fecal bile acids and fecal neutral sterols were elevated substantially, indicating a higher rate of degradation of cholesterol. Thus hypolipidemic activity of these flavonoids may be due to a lower rate of lipogenesis and higher rate of degradation.